步驟，具體的制備方法如下:
[0033](I)向100mL燒杯中分別加入1mmoI NiSO4.6H20、CoS04.7H20和MnSO4.H2O,然后加入500mL去離子水至完全溶解。加入適量氨水調節溶液pH= 10。配置2001^濃度為27.5μg/mL碳酸鈉溶液，然后在70°C下加熱攪拌條件下逐滴加入金屬鹽溶液中，直至沉淀完全。用去離子水洗滌沉淀3次，過濾后所得沉淀于70°C干燥箱中干燥10小時；
[0034](2)使用瑪瑙研缽將步驟(I)所得到的沉淀充分研磨I小時；
[0035](3)將步驟(2)所得研磨充分的沉淀裝入坩禍中，然后以2°C/min的升溫速率升至8000C，保溫15小時，然后自然冷卻，即得終產物MnCoN14。
[0036]所制備的鎳、鈷、錳復合金屬氧化物材料MnCoN14的掃描電子顯微鏡照片如圖1所示，該材料為形貌均一的球形顆粒，直徑約為Ζμπ^Χ射線衍射圖譜如圖2所示，該材料結晶度尚，兩相并存，其中一相為尖晶石相，另外一項為N1相。圖2中分別標記出各峰對應的晶面。
[0037]實施例2:
[0038]鎳、鈷、錳復合金屬氧化物材料MnCoN14分離富集溶液中六聚組氨酸標記的黃色熒光蛋白，其具體步驟如下:
[0039]200ygMnCoNi04微球與500yL 20yg/mL的六聚組氨酸標記的黃色熒光蛋白溶液室溫下旋轉混合5min，在1000rpm轉速下離心2min，棄去清液。然后向離心管中加入200yL磷酸鹽緩沖溶液(PH=7.40),混合Imin，離心后棄去上清液。該洗滌過程重復2次。最后向離心管底部加入20yL lmol/L咪卩坐溶液，旋轉混合5min，在1000rpm轉速下離心2min，保留上清液。該上清液即為使用復合金屬氧化物材料MnCoN14富集得到的六聚組氨酸標記的黃色熒光蛋白溶液。將離心管底部材料用200yL lmol/L咪唑溶液超聲洗滌30min后，按照上述步驟，可再次進行六聚組氨酸標記的黃色熒光蛋白的分離富集，可至少循環使用8次。
[0040]MnCoN14微球與六聚組氨酸標記的黃色熒光蛋白溶液混合后5min，表面能夠吸附大量的黃色熒光蛋白，經過lmol/L咪唑溶液洗脫后，六聚組氨酸標記的黃色熒光蛋白幾乎可以完全從MnCoN14材料表面解吸下來，材料表面幾乎檢測不到熒光信號。圖3表明MnCoN14材料的循環使用性能優異，循環使用8次，仍可保持60 %的吸附容量。
[0041 ] 實施例3:
[0042]鎳、鈷、錳復合金屬氧化物材料MnCoN14分離純化細胞裂解液中六聚組氨酸標記的綠色熒光蛋白，其具體步驟如下:
[0043]將表達了六聚組氨酸標記的綠色熒光蛋白的大腸桿菌超聲裂解，然后以12000rpm的離心速率離心20min，保留上清液。然后向200yL上清液中加入200ygMnCoNi04微球，室溫下旋轉混合5min，在1000rpm轉速下離心2min，棄去清液。然后向離心管中加入200μLlOmmol/L咪唑溶液，混合lmin，離心后棄去上清液。該洗滌過程重復3次。最后向離心管底部加入20yL lmol/L咪卩坐溶液，旋轉混合5min，在1000rpm轉速下離心2min，保留上清液。該上清液即為分離純化后的六聚組氨酸標記的綠色熒光蛋白溶液，可直接用于后續研究。
[0044]圖4是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測純化前裂解液、洗滌液以及最終的解吸液中六聚組氨酸標記的綠色熒光蛋白的結果。未純化前，細胞裂解液中含有大量的非目標蛋白(條帶I)，經過3次洗滌后，洗滌液中已無明顯蛋白條帶，證明已洗滌干凈。在解吸液(條帶
4)中，檢測到分離純化后的六聚組氨酸標記的綠色熒光蛋白，且并沒有明顯的非特異性吸附蛋白，表明MnCoN14對六聚組氨酸標記的蛋白有極高選擇性和特異性，能夠在復雜的細胞裂解液中選擇性吸附六聚組氨酸標記的蛋白。
[0045]實施例4:
[0046]將MnCoN14材料裝入層析柱，對細胞裂解液中的六聚組氨酸標記的綠色熒光蛋白進行批量純化，其具體步驟如下:
[0047]首先將MnCoN14材料作為填料裝入合適的層析柱，用磷酸鹽緩沖溶液(pH= 7.40)進行沖洗。然后收集已表達六聚組氨酸標記的綠色熒光蛋白的大腸桿菌，將其裂解，以12000rpm轉速離心后取上清液。將該上清液上樣至層析柱中，流速控制在15-20mL/小時左右。用5倍上樣量體積的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.40)洗滌，流速控制在30mL/小時左右。然后用2倍上樣量體積的一定梯度的咪唑溶液進行洗脫，咪唑溶液的濃度分別為lOOmmol/L，200mmol/L，500mmol/L和lmol/L。流速控制在15-20mL/小時左右。收集洗脫液，確定六聚組氨酸標記的綠色熒光蛋白在洗脫液中的分布情況。最終確定適宜濃度的咪唑溶液作為洗脫液，再按照上述步驟進行層析，即可得到純化的六聚組氨酸標記的綠色熒光蛋白。該方法可批量分離純化六聚組氨酸融合蛋白。
【主權項】
1.一種復合金屬氧化物材料，分子式為MnCo(2-x)Nix04，其中X= O?l，Ni元素的質量百分含量為0%?25%，其特征在于，該材料的微觀形貌為微米級的尺寸可控的微球，所述微球是由納米晶組成的球形中空結構。2.如權利要求1所述的復合金屬氧化物材料，其特征在于，該材料中Ni元素的質量百分含量為10%?20%。3.如權利要求1所述的復合金屬氧化物材料，其特征在于，該材料的微觀形貌為直徑500nm?5μηι的微球，組成該微球的納米晶尺寸為50?200nm。4.權利要求1?3任一所述復合金屬氧化物材料的制備方法，包括以下步驟: 1)將Mn、Co、Ni的金屬鹽按照相應的摩爾比配制金屬離子的混合溶液，并調節溶液pH至10 ?12; 2)配制沉淀劑溶液，使過量的沉淀劑與步驟I)得到的金屬離子混合溶液反應，使其沉淀完全; 3)用去離子水洗滌沉淀，然后烘干； 4)將烘干后的沉淀充分研磨，然后進行高溫處理，冷卻后得到反應終產物。5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟I)所述金屬鹽為所述金屬的硫酸鹽、硝酸鹽或氯化物;用氨水調節溶液的pH。6.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟2)以可溶性碳酸鹽或氫氧化物作為沉淀劑。7.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟2)在磁力攪拌速率為600?900r/m，溫度為室溫至75°C的條件下，向沉淀劑溶液中逐滴加入金屬離子的混合溶液。8.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟4)高溫處理溫度為700?950°C，反應時間為10?20小時，然后自然冷卻。9.權利要求1?3任一所述復合金屬氧化物材料作為多聚組氨酸融合蛋白親和純化材料的用途。10.如權利要求9所述的用途，其特征在于，在適當緩沖溶液中，所述復合金屬氧化物材料通過金屬螯合作用特異性識別并吸附多聚組氨酸融合蛋白，然后再通過適當的洗脫液將多聚組氨酸融合蛋白洗脫下來，實現多聚組氨酸融合蛋白的分離純化。
【專利摘要】本發明公開了一種功能化復合金屬氧化物材料及其制備方法和應用。本發明通過將共沉淀法與高溫固相法有機結合，加以沉淀速率和反應溫度的合理控制，制備出形貌規整、尺寸可控的鎳、鈷、錳復合金屬氧化物納微米級微球。基于金屬離子與組氨酸的螯合作用，多聚組氨酸融合蛋白可吸附在該微球材料表面，而后又可被洗脫液快速洗脫。該微球材料的制備方法簡便易行，成本低廉，便于批量生產，所制備的鎳、鈷、錳復合金屬氧化物納微米級微球材料形貌均一可控，可用于快速高效地分離純化復雜生物樣本中的多聚組氨酸融合蛋白，并實現多次循環使用，具有很高的商業應用前景。
【IPC分類】B01J20/06, C07K1/22, C07K19/00, B01J20/30
【公開號】CN105597657
【申請號】CN201510612187
【發明人】白玉, 祁曉月, 劉虎威
【申請人】北京大學
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2015年9月23日