[0071] 1、GLW2基因過表達表達載體構建
[0072] 本實施例采用表達載體PHB(Mao等，2005，PNAS102:12270-12275，可商購）作為水 稻轉基因的載體。該載體編碼一個細菌復制起點（ori)、卡那霉素抗性基因（Karf)、潮霉素 抗性基因（HygO、除草劑抗性基因（Baf)、2 X 35S啟動子、N0S基因終止信號序列以及用于連 接目的片段的多克隆位點(MCS)。在限制性內切酶位點可插入GLW2基因或其片段構建成轉 基因質粒。
[0073] 以正常野生型IR24品種的RNA為模板，合成第一鏈cDNA，用該GLW2基因0RF序列的 5'和3'端的寡核苷酸作為PCR引物(SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4)，用高保真酶進行擴增，獲 得約1185bp的GLW2基因的全長cDNA擴增產物。將該擴增產物通過重組克隆方法重組進載體 pHB中，并對重組子進行測序驗證。該重組的過渡質粒載體稱為PHB-GLW2。其中GLW2基因的 表達由自身啟動子驅動。
[0074] 5'端的寡核苷酸序列3為(SEQ ID N0.3):
[0075] 5'-gtctctctctcaagcttggatcc ATGGCGATGCCGTATGCCTCC-3'
[0076] 3'端的寡核苷酸序列4為(SEQ ID N0.4):
[0077] 5'-tctagaggatcaattcgagctc TCAGTCACCATTAGTTGATCGAG-3'
[0078] 2、GLW2敲除載體構建
[0079] 利用CRISPR/Cas9系統構建載體，載體名稱為BGK03(百格生物技術公司購買），載 體結構示意圖如圖1所示。采用水稻U6啟動子，能夠高效的用于單子葉植物，特別是水稻;采 用加強型玉米UBI啟動子，高效表達Cas9蛋白；CaMV 35S啟動子表達潮霉素抗性基因。
[0080] 首先設計并生成gRNA靶點序列。識別序列一般選擇19bp，例如選擇靶點序列 GCTCATATACAAGTACCTGGTGG(下劃線部分的TGG為PAM序列），然后設計靶點序列（SEQ ID N0.5)和(SEQ ID N0.6)，將合成的引物加水溶解至ΙΟμΜ，按下列反應體系混合后，95°C加熱 3分鐘，然后以約0.2°C/秒緩慢降至20°C (推薦采用PCR儀）。最后在酶的作用下將上步反應 中生成的引物二聚體構建入載體BGK03，構建好的載體名稱為BGK03-GLW2。
[0081 ] 5'端的寡核苷酸序列5為(SEQ ID N0.5):
[0082] 5 '-TGTGTGCTCATATACAAGTACCTGG-3 '；
[0083] 3'端的寡核苷酸序列6為（SEQ ID N0.6):
[0084] 5 '-AAACCCAGGTACTTGTATATGAGCA-3 '；
[0085] 3、GLW2基因轉化水稻試驗
[0086] 將上PHB-GLW2和BGK03-GLW2通過凍融法導入農桿菌EHA105。農桿菌EHA105平板(4 °C保存)挑取單菌落于YEP液體培養基(Km和Rif各50mg/L)中，28°C振蕩培養12~18h，然后 取1~5mL菌液接到100mL YEP液體培養基(含乙酰丁香酮100μ mol/L)中，振蕩培養4h后測0D 值稀至相應濃度(0D = 0.5)。將新鮮菌液于8000印111、4°(：、51^11收集菌體，并重懸于三分之一 提及的AAM培養基中。加入放有生長旺盛的胚性愈傷組織的滅菌三角瓶中浸泡25min，再吹 干表面菌液，將愈傷組織轉接于共培養基上，28°C暗培養2~3d。共培養愈傷組織經無菌水 和含Cef 500mg/L的無菌水漂洗后，在工作臺上吹4h左右，轉接于預培養基中28°C暗培養5 ~7d。將預培養的愈傷組織轉接于含Hyg和Cef的篩選培養基上繼續培養3~4周，再將抗性 愈傷組織轉接于僅含Hyg的篩選培養基上，篩選1~2次。取抗性愈傷組織轉接于分化培養基 上，28°C光照分化。分化小苗轉接于生根培養基，28°C光照培養3~4周，開放培養煉苗7d左 右，最后移栽到大田。
[0087] 獲得的再生植株移栽成活后用除草劑或潮霉素篩選轉化植株;陽性植株提取葉片 總DNA，經PCR進一步鑒定轉化植株。用轉基因 T1代調查育性表型，驗證GLW2基因功能。
[0088] 實施例2 GLW2基因功能分析
[0089] 如實施例1所述的方法獲得水稻GLW2過量表達的轉基因植株，分為2組，分別命名 為0Ε1-2、0Ε2-3，以及正常對照組control，用轉基因 T1代植株觀察水稻籽粒表型，結果如圖 3~7所示，其中，圖4~7中，林為在0.01水平上顯著NS為無意對照）。
[0090] 從圖中可以看出，轉GLW2過量表達基因的植株籽粒粒長、粒寬和千粒重較對照有 顯著增加。表明GLW2過量表達會增加籽粒粒長、粒寬，進而導致千粒重增加。
[0091 ]如實施例1所述的方法獲得水稻GLW2敲除的轉基因植株，分為4組，分別命名為 Κ01-1、Κ01-2、Κ01-5以及K02-3，WT為野生型材料，用轉基因 T1代植株觀察水稻籽粒表型，其 中，GLW2敲除植株敲除位點如下表3所示：
[0092]表3 GLW2敲除植株敲除位點分析 [0093]
[0094] 結果如圖8~11所示，圖8中NIL-527R為背景的近等基因系，圖9~11中，林為在 0.01水平上顯著。從圖8~11可以看出，GLW2基因編輯后的植株的籽粒粒長、粒寬和千粒重 較對照有顯著降低。表明GLW2敲除會降低籽粒粒長、粒寬，進而導致千粒重降低。
[0095] 從上述分析可以看出，GLW2可以控制水稻籽粒粒長、粒寬，進而影響水稻產量，上 調該基因表達有利于植株籽粒粒長、粒寬增加，下調該基因表達則降低植株的籽粒粒長、粒 寬。
[0096] 實施例3 GLW2基因突變的表型(GLW2位自然突變材料）
[0097] GLW2基因突變后的水稻品種307R(保存于四川農業大學水稻研究所資源中心），經 表性分析和統計分析表明，307R籽粒相比于現有的正常水稻品種527R、IR24以及M63而言， 其粒長、粒寬及千粒重較其他水稻材料有顯著增加(圖12和表4)。
[0098] 表4正常水稻品種和307R完熟籽粒考種值統計
[0099]
[0100] 相比于現有技術的缺點和不足，本發明具有以下有益效果:本發明水稻粒型控制 基因(GLW2)為水稻等植物的籽粒粒型調控提供新的技術途徑;GLW2基因在去除轉基因成分 影響方面具有廣泛的應用前景;該基因可以顯著提高水稻產量，在水稻雜種優勢利用中具 有廣泛的應用前景。
[0101] 以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種水稻粒型相關蛋白GLW2，其特征在于，具有如SEQ ID NO. 2所不的氣基酸序列； 或為SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形 成的具有同等功能的氣基酸序列。2. 權利要求1所述的水稻粒型相關蛋白GLW2的編碼基因，其特征在于，該編碼基因的核 苷酸序列為:具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列;或，在嚴格條件下與SEQ ID NO.1所示 的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。3. 如權利要求2所述的水稻粒型相關蛋白GLW2的編碼基因，其特征在于，所述嚴格條件 為0 · 2 X SSC，0 · 1 % SDS，60 °C ;或50 % (V/V)甲酰胺，0 · 1 % 小牛血清/0 · lFico 11，42 °C。4. 含有權利要求2或3所述的編碼基因的表達載體。5. 如權利要求4所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體包括PHB、BGK03。6. 含有權利要求2或3所述的編碼基因，或含有權利要求4或5所述的表達載體的宿主細 胞。7. 權利要求1所述的水稻粒型相關蛋白GLW2在控制水稻籽粒粒長、粒寬的改良、提高水 稻產量中的應用。8. 權利要求2或3所述的編碼基因在控制水稻籽粒粒長、粒寬的改良、提高水稻產量中 的應用。9. 權利要求1所述的水稻粒型相關蛋白GLW2在制備轉基因植株中的應用。10. 權利要求2或3所述的編碼基因在制備轉基因植株中的應用。
【專利摘要】本發明提供了一種水稻粒型相關蛋白GLW2及其編碼基因與應用，該GLW2蛋白具有如SEQ？ID？NO.2所示的氨基酸序列，或為SEQ？ID？NO.2所示的氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的具有同等功能的氨基酸序列；該編碼基因具有如SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列，或在嚴格條件下與SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。本發明GLW2編碼基因重組在表達載體并轉化水稻后，過表達GLW2能夠增加水稻籽粒粒長、粒寬，提高水稻產量。
【IPC分類】C12N15/29, C12N15/82, A01H5/00, C07K14/415
【公開號】CN105646684
【申請號】
【發明人】李雙成, 李平, 高烽焱, 王世全, 鄧其明, 鄭愛萍, 朱軍, 劉懷年, 王玲霞
【申請人】四川農業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月8日