一種提高米曲霉曲酸產量的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及發酵工程領域，具體地涉及通過優化培養基關鍵組分濃度和孢子濃度，控制菌球大小，從而提高米曲霉曲酸產量的方法。
【背景技術】
[0002]曲酸是一種與葡萄糖結構相似的有機酸，是由好氧微生物利用糖類發酵產生的次級代謝產物，廣泛存在于酒類、醬油及豆瓣醬等釀造產品中。目前，國內外主要利用米曲霉(Aspergillums oryzae)及不產黃曲霉毒素的黃曲霉(Aspergillus flavus)發酵生產曲酸。由于具有抑菌能力、抗氧化性、抑制酪氨酸酶活性、與金屬離子螯合等性質，曲酸常用作防腐劑、殺蟲劑、抗菌劑等，被廣泛應用在醫藥、農業、食品及化妝品等各個行業。
[0003]曲霉作為典型的絲狀真菌，液態深層發酵與其他單細胞微生物相比，一個顯著的特征是個體形態具有明顯的變化，易形成多種形態，使其發酵過程變得復雜與難以控制。絲狀真菌在液態發酵過程中菌體形態主要分為絲狀、球狀、團狀，這主要由自身的遺傳特性與環境因素共同影響。菌體的形態受多個基因調控，影響曲霉屬菌體形態發育的基因主要有1^?4/^0(^、117口(:、8￥(^和86口4等。通過這些基因編碼的蛋白質維持菌絲極性、控制細胞大小或細胞間隔膜的間距、組織肌動蛋白微絲和促進菌絲尖端生長等來改變菌體形態。影響菌體形態的環境因素主要包括培養基組成(如碳氮源的種類及濃度、磷酸鹽的水平、金屬離子的添加等)、環境條件(如溫度、pH、轉速、溶解氧及二氧化碳水平、機械剪切力、通氣量等)、接種量、孢子形狀、表面活性劑的種類、補料方式等。
[0004]對于絲狀真菌而言，菌體的外觀和微觀上的變化與酶、代謝產物的合成及分泌有著密切的關系，也會導致整個發酵過程參數(如流變性等)截然不同，對目標產物的產率有重要影響。發酵不同產物達到最高發酵強度的菌體最佳形態也不相同。然而，目前關于米曲霉菌體形態和曲酸生產的研究還有不足，本領域迫切需要開發有效提高曲酸產量的方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于，提供一種提高米曲霉曲酸產量的方法。本發明涉及一株株米曲霉菌株(Aspergillus oryzae QS)，已于2014年9月20日保藏于中國典型培養物保藏中心(保藏單位地址:湖北省武漢市武昌區八一路299號武漢大學)，保藏編號CCTCC M 2014436。
[0006]為實現上述目的，本發明涉及兩方面的技術方案:
[0007]本發明的第一方面，提供了一種提高米曲霉產量的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008](i)從保藏管中取一環孢子懸液接種于斜面培養基，25?35°C培養4?6d;
[0009](ii)將培養4?6d的成熟孢子用無菌生理鹽水洗下，經玻璃珠打散后過濾制成孢子懸浮液，并用血球計數板計數；
[0010](iii)將孢子懸浮液轉接至種子培養基中，培養轉速150?250r/min，在25?35°C下培養20?40h;
[0011](iv)按6?15% (v/v)的接種量，將液體種子接種到發酵培養基，轉速150?250r/min，25?35°C下恒溫搖床培養3?5d ；
[0012]其中，步驟(iv)中所述的液體種子的菌球直徑為0.25?0.35mm。
[0013]在另一優選例中，所述發酵培養基的裝液量為250mL三角瓶中裝20?40mL培養基。
[0014]本發明的第二方面，提供了一種提高米曲霉曲酸產量的方法，包括種子液中菌球直徑的控制。
[0015]在另一優選例中，所述菌球直徑為0.1?0.5mm，較佳的0.2?0.4mm，最佳的0.25?
0.35mm0
[0016]在另一優選例中，所述方法包括種子培養基關鍵組分對菌球直徑的影響。
[0017]在另一優選例中，所述方法包括孢子懸浮液濃度對菌球直徑的影響。
[0018]在另一優選例中，所述種子培養基中的葡萄糖濃度為60?160g/L。
[0019]在另一優選例中，所述種子培養基中的酵母提取物濃度為25?15g/L。
[°02°] 在另一優選例中，所述孢子懸浮液的孢子濃度為107?108個/mL。
[0021 ]在另一優選例中，所述孢子懸浮液的接種量為6?15%。
[0022]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【附圖說明】
[0023]圖1顯示了葡萄糖濃度對菌球直徑的影響。
[0024]圖2顯示了酵母提取物濃度對菌球直徑的影響。
[0025]圖3顯示了孢子濃度對菌體形態及菌球直徑的影響。
[0026]圖4顯示了菌絲與菌球形態對曲酸產量的影響。
圖5顯示了菌球直徑與單位細胞合成曲酸能力的關系。
【具體實施方式】
[0027]本發明人經過廣泛而深入的研究，首次意外地發現一種提高米曲霉曲酸產量的方法。實驗表明，米曲霉菌球的直徑隨著葡萄糖濃度提高而增大，隨著酵母提取物濃度提高菌球直徑先減小后增大。米曲霉發酵生產曲酸的最佳形態為菌球，并且菌球直徑與曲酸合成能力關系密切，菌球直徑為0.25?0.35mm時，單位細胞曲酸積累量最高。
[0028]通用材料和方法
[0029]丨.培養方法
[0030]生孢培養:從-70°C的甘油保藏管中取一環孢子懸液接種于斜面培養基，30°C恒溫培養箱中培養5d。
[0031]種子培養:將培養5d的成熟孢子用無菌生理鹽水洗下，經玻璃珠打散后過濾制成孢子懸浮液，用血球計數板計數。將孢子懸浮液轉接至種子培養基中，培養轉速200r/min，在30 °C下恒溫搖床培養30h。
[0032]發酵培養:按10%(v/v)的接種量，將液體種子接種到發酵培養基中，發酵培養基的裝液量為250mL三角瓶中裝入30mL培養基，轉速200r/min，30°C下恒溫搖床培養4d。
[0033]2.分析方法
[0034]曲酸含量測定:采用三氯化鐵比色法測定。
[0035]生物量測定:采用干重法，將發酵液經濾紙過濾后用蒸餾水洗滌，置于干燥箱中65°C烘干至恒重，用稱重法測定其生物量。
[0036]菌體形態測定:光學顯微鏡觀察并拍攝，菌球直徑用顯微鏡標尺測量。
[0037]粘度測定:取30mL發酵液用Brookfield DV-S數顯粘度計進行測定，選用轉子型號為4#，轉速為60 %。
[0038]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0039]除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0040]實施例1葡萄糖濃度對菌球直徑的影響
[0041 ]將生孢培養基中的孢子用無菌生理鹽水洗下，制成孢子懸浮液后，接種到含有不同葡萄糖濃度(60?160g/L)的種子培養基中，培養30h后測定菌球大小。結果表明，隨著種子培養基中葡萄糖濃度的逐漸增大，A.0ryzae菌球直徑也隨之由0.23mm增大到0.463mm(見圖1)。
[0042 ]實施例2酵母提取物濃度對菌球直徑的影響
[0043]同實施例1中孢子懸浮液的制備，然后接種到含有不同酵母提取物濃度(2.5?15g/L)的種子培養基中，于30°C條件下，培養30h后測定菌球大小。結果顯示，酵母提取物對A.0ryzae菌球大小的影響不同于葡萄糖，當酵母提取物濃度從2.5g/L提高至10g/L時，A.0ryzae菌球直徑從0.52mm降低到0.265mm，之后隨著酵母提取物濃度繼續提高菌球直徑也增大(見圖2)。
[0044]實施例3孢子濃度對菌球形成的影響
[0045]制備不同濃度的孢子懸浮液，分別接種到相同配方的種子培養基中，培養30h后測定菌球大小。結果如圖2所示，當孢子懸浮液濃度為17?1iMVmIJt，A.0ryzae主要形成菌球(見圖3A a/c)，且在一定范圍內菌球直徑與孢子濃度呈負相關，即孢子懸浮液濃度越高，菌球直徑越小，接種孢子濃度為2 X 17個/mL的菌球直徑為是孢子濃度為1.2 X 18個/mL的3.61倍(見圖3B)。
[0046]實施例4基于形態的曲酸發酵優化
[0047]將種子液培養過程中獲得的不同形態的菌體，接種至發酵培養基。在本實施例中，測定了曲酸產量，研究了菌體形態對A.0ryzae生產曲酸的影響。當菌體形態為菌球時，A.0ryzae的產酸能力較高，曲酸產量達到15.1lg/L，相比菌絲明顯提高(見圖4)，A.0ryzae發酵生產曲酸的最佳形態為菌球。
[0048]實施例5菌球直徑對曲酸產量的影響
[0049]將不同大小的菌球接種到發酵培養基中進行發酵培養，測定曲酸產量。菌球直徑對曲酸產量有一定的影響，最佳菌球直徑范圍為0.25?0.35mm，此時單位細胞曲酸積累量最高為0.778g/g(見圖5)。
[0050]在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
【主權項】
1.一種提高米曲霉曲酸產量的方法，其特征在于，包括控制種子液的菌球直徑。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌球直徑為0.25?0.35mm。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法通過改變種子培養基中的葡萄糖和酵母提取物濃度及孢子濃度來控制菌球直徑。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括制備種子液的步驟:將米曲霉接種于生孢培養基中，然后用無菌生理鹽水將成熟孢子洗下，玻璃珠打散后將孢子懸浮液接種至種子培養基中。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述孢子懸浮液濃度為16?18個/mL。6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，將種子液以3?20%的接種量接種至發酵培養基中。7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，生孢培養基為(g/L):葡萄糖50，玉米淀粉10，酵母提取物5，KH2P04 5,MgSO4.7H20 2.5，瓊脂20。8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，種子培養基為(g/L):葡萄糖(50?200)，玉米淀粉10，酵母提取物(I?20)，KH2P04 5,MgSO4.7Η20 2.5。9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，發酵培養基為(g/L):葡萄糖120，酵母提取物3，豆餅粉5，KH2P04 2,MgSO4.7Η20 0.5。10.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述種子培養條件為:轉速200r/min，30°(:恒溫培養30h。11.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述發酵培養條件為:裝液量為20?40mL培養基(250mL三角瓶)，轉速200r/min，30°C恒溫發酵4d。
【專利摘要】本發明提供了一種提高米曲霉曲酸產量的方法，屬于發酵工程技術領域。具體地，通過改變培養基關鍵組分的濃度與接種條件控制米曲霉的菌落形態為球形(菌體處于最佳產酸形態)，進而提高曲酸產量。當菌體形態為菌球時，米曲霉(A.oryzae)的產酸能力比菌絲時明顯提高，曲酸產量可達15.11g/L。同時，菌球直徑范圍為0.25～0.35mm時，單位細胞曲酸積累量最高為0.778g/g。本發明優化了種子培養基中葡萄糖、酵母提取物濃度和孢子濃度，控制菌球大小，從而提高了米曲霉單位細胞曲酸產量，具有很好的應用前景。CCTCC NO:M 201443620140920
【IPC分類】C12P17/06, C12R1/69, C12N1/14
【公開號】CN105647815
【申請號】
【發明人】楊海泉, 沈微, 華珊, 陳獻忠, 許菲, 劉晗, 樊游
【申請人】江南大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月16日