[0050] 一、NES1在合成萜烯類化合物芳樟醇和(E)-橙花叔醇中的應用 [0051 ] 1、載體構建
[0052] 以T-NES1測序載體為模板，利用高保真酶TranStartFastPfu DNA Polymerase及 引 物 NES1F(5' -AACTCATCAATGTCTTCTTCAACTA-3, )/NESlR(5' -AAATTTGAATCATACAACACAATAGG-3'），得到1758bp的帶有A末端的目的片段(具有序列表中序 列1的核苷酸）。將上述帶有A末端的目的片段參照全式金生物有限公司pEASY-El Expression Kit說明書與載體pEASY-El連接，得到的連接產物轉入普通大腸桿菌后涂于含 Amp (50mg/ml)的LB平板上過夜培養。
[0053] 挑取單克隆利用T7F (5 ' - TAATACGACTCACTATA- 3 '）及目的基因下游引物NES1R進行 檢測，得到陽性克隆（圖2)。將陽性克隆提取質粒送去測序，該質粒為將序列表中序列1自5' 末端第41 -1780位核苷酸利用TA克隆的方法插入載體pET28a的Xho I和Nde I酶切位點酶切 位點間得到的載體，命名為pET28a - NES1。
[0054] 將pET28a-NESl轉化BL21(DE3)感受態細胞，轉化過程見全式金生物有限公司BL21 (DE3)Chemically Competent Cell說明書，得到BL21(DE3)/pET28a-NESl,將BL21(DE3)/ pET28a-NESl利用T7F及目的基因下游引物進行PCR檢測，證明pET28a-NESl已轉入大腸桿菌 中。
[0055] 2、NES1蛋白的誘導表達、分離及純化
[0056] 將BL21(DE3)/pET28a-NESl在加入lμM的IPTG的LB培養基中培養，條件為16°C 180rpm、誘導12h，得到培養產物，將培養產物于4°C，1000rpm離心10min收集上清液。
[0057] 將上清液利用AKTA FPLC system(Amersham)，HiLoad_16/60_superdex_75_prep_ grade (global)分子篩預裝柱分離純化(4ml上樣環，洗脫流速：lml/min，每lml收集一次;洗 脫液(50mM Na2HP〇4,300mM NaCl，250mM imidazole，Na0H調pH至8.0,獲得純化的NES1 蛋白 (圖3)(為收集2柱體積的洗脫液）。
[0058] 3、NES1蛋白酶活性鑒定
[0059]利用蛋白超濾膜離心管，將收集2柱體積的洗脫液（純化NES1蛋白）用pH為7.0， 50mM PBS(通過將39ml的0.2M的NaH2P〇4、與61ml的0.2M的Na2HP〇4、混勻后獲得）置換，并將 蛋白濃縮4μg/ml。為防止有機溶劑的污染，以下均采用玻璃器皿。按照表1的體系進行反應， 體系lmL，37°C，30min，得到反應產物。以水替代純化NES1蛋白作為對照。
[0060] 表1為TaFPS蛋白酶活性鑒定反應體系
[0061]
[0062] 反應結束后，每個樣品瓶子中加入500μ1的二氯甲燒，渦旋lmin，冰上放置30min， 抽提產物。小心吸取上清至新的玻璃瓶中，利用穩定的氮氣流（14PSI)吹到只剩2ul (約 5min)，加入10μ1的二氯甲烷，待用。
[0063] 取 ΙμL 樣品進樣，利用氣質聯用系統 GC-MS(HP6890/HP5973, Hewlett-Packard 公 司），色譜柱HP - 5MS (60m X 250μπι X 0 · 25μπι; Hewl e tt - Packard公司），GC-MS儀器進行分析。升 溫程序為:40°C保持lmin，以5min5°C的增量升到2501€(1°(：/1^11)，最后250°(：保持171^11 (^ 檢測范圍為40-550Da，溫度為170°C。
[0064] GC-MS檢測兩組的反應產物，結果如圖4所示（A)芳樟醇標樣的出峰時間 (11.97min)和質譜圖；（B)NES1蛋白催化GPP產物的出峰時間（11.97min)和質譜圖；（C)(E)_ 橙花叔醇標樣的出峰時間（19.18 m i η)和質譜圖；（D) N E S1蛋白催化F P P產物的出峰時間 (19.18min)和質譜圖。通過和標樣的出峰時間和質譜圖對比，說明純化NES1蛋白可催化香 葉草基焦磷酸（geranylpyrophosphate，GPP)合成芳樟醇和催化法尼基焦磷酸 (farnesylpyrophosphate，FPP)合成(E)-澄花叔醇。
[0065] 二、NES1在水稻揮發芳樟醇和DMNT中的應用
[0066] 1、轉NES1水稻的獲得
[0067] 把NES1基因連接到pCAMBIA-1300-EPSPS載體。通過農桿菌介導的水稻轉化技術， 把NES1基因轉到水稻品種中花11，通過草甘膦篩選鑒定轉基因陽性植株。從To代轉NES1水 稻收獲種子、播種，得到T2代轉NES1水稻。提取h代轉NES1水稻和野生型水稻的cDNA為模板， 利用NESRT- F: 5 ' - CTCATCTGCACCTGTCACTAC- 3 '，NESRT- R: 5 ' - TGCTTCCAACCTACTCATTCTT - 3 ' 為引物對，進行qRT - PCR擴增；以水稻Ac t iη基因為內參，所用引物為六(^111 + :5'-TCCGGTGGATCTTCATGCTTACCT-3'，Actin-R:5'-ATGGACCATTGCGACGAGTCTTCT-3'
[0068] 在ABI PRISM7900實時熒光定量PCR儀升進行操作，設3次重復。結果如圖5所示， NES1在野生型水稻葉片中沒有表達，在T2代轉NES1水稻中有表達。
[0069] 2、轉NES1水稻的產生萜烯類化合物芳樟醇和DMNT
[0070] A:水稻的氣體收集
[0071]為了避免土壤中揮發物的影響，利用ddH20將土洗凈后，將植物放入玻璃瓶中，并 灌滿ddH20以保證植物正常生長。利用頂端開小口的玻璃容器、密閉的鋁質金屬底座以及金 屬夾子組裝成相對封閉的系統，對水稻進行氣體收集。按照密閉的原則組裝裝置，使氣體利 用真空栗通過炭柱過濾后進入裝置，含有吸附劑的玻璃管連接于出氣口。進氣的流速 (600ml/min)略大于出氣的流速(400ml/min)。
[0072]選擇4周大的T2代轉NES1水稻進行氣體采集。采用50mg Tenax TA聚合物進行收 集。Tenax玻璃管使用前利用5ml重蒸乙醚清洗3次后，在持續的氮氣通過的條件下220°C加 熱2h; PorapaK Q玻璃管則使用前利用lmL超純乙醚清洗3次以上后，在持續的氮氣通過的條 件下132°C加熱2h。氣體收集完畢后，Tenax玻璃管直接用于GC-MS分析，PorapaK Q玻璃管則 需要利用250μ1重蒸乙醚洗脫2次(共500μ1)至安捷倫玻璃瓶中，待用。以野生型水稻為對 照。分別得到野生型水稻揮發物樣品和!^代轉NES1水稻揮發物樣品。
[0073] Β:轉NES1的水稻植株的揮發物GC-MS分析
[0074] 用GC-MS(Agilent公司6890Ν，色譜柱參數：長50mX內徑0 · 32_X薄膜厚度0 · 52μπι 的非極性色譜柱；電離參數:70^，220°(：;氣相色譜爐溫度保持在301€5分鐘，然后每分鐘5 °C升溫至250Γ攝氏度。對野生型水稻植株的揮發物樣品和!^代轉NES1水稻植株的揮發物 樣品進行檢測，對標準樣品芳樟醇和DMNT也按該條件進行檢測，通過與標樣的出峰時間和 質譜進行對比后發現，T 2代轉NES1水稻的揮發物明顯增多（圖6)，產物為芳樟醇和DMNT，同 時用芳樟醇和DMNT構建標準曲線，進行揮發物的定量研究，發現芳樟醇和DMNT的含量在野 生型水稻植株和轉NES1水稻植株間差異顯著(p〈0.05)(圖7)。
[0075]三、NES1基因在吸引二化螟盤絨繭蜂中的應用
[0076] 用Y型嗅覺儀檢測上述各植株揮發物對二化螟絨繭蜂雌蟲對的取食反應的影響， 具體如下：
[0077] 二化螟盤絨繭蜂在光照培養箱中用二化螟飼養，挑選二化螟盤絨繭蜂雌蟲進行行 為研究。Y形嗅覺儀主臂20cm，兩側臂15cm，側臂間夾角60°。通過LS-2800型氣栗推動空氣進 入系統，氣流經活性炭、蒸餾水凈化加濕后通過玻璃轉子流量計進入Y形管兩側，流速控制 在0.5L/min。測試時，把轉基因水稻每株放到一個玻璃罐中，作為氣味源，放入某一側臂，以 野生型水稻作為對照放入另一側臂。從基管端部接入寄生蜂，每頭寄生蜂觀察5min，如寄生 蜂爬過側壁1/3處并停留lmin以上記為對該物質有反應，否則記為無反應。測試溫度為(25 ± 2) °C。重復3次，每次測試25頭寄生蜂。
[0078] 結果如圖8所示，為Y型嗅覺儀檢測轉NES1的水稻揮發物對二化螟絨繭蜂雌蟲對的 取食反應的影響，結果顯示，經卡方測驗轉基因株系與野生型對照植株差異極其顯著(x2 = 44.78，？〈0.01)。說明1'2代轉呢51水稻揮發物樣品對二化螟盤絨繭蜂具有顯著的吸引作用。
【主權項】
1. 一種與萜烯類化合物合成相關的蛋白，具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。2. 根據權利要求1所述的蛋白，所述萜烯類化合物為芳樟醇和(E)-橙花叔醇。3. 權利要求1或2所述的蛋白的編碼基因。4. 根據權利要求3所述的編碼基因，具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列或者SEQ ID NO: 1的5 '末端第41 -1780位所示的核苷酸序列。5. 含有權利要求3或4所述的編碼基因的重組載體或轉基因細胞系或重組菌。6. 根據權利要求5所述的重組載體，為將權利要求3或4所述的編碼基因插入到表達載 體中，得到表達蛋白的載體，所述表達載體為pET28a，編碼基因插入到表達載體的Xho I和 Nde I間；或者所述重組菌為將上述的重組載體導入目的菌得到的重組菌，所述目的菌為大 腸桿菌。7. 權利要求1所述的蛋白或權利要求2或3所述的編碼基因或權利要求5所述的重組載 體或所述的重組菌在合成萜烯類化合物和/或吸引二化螟盤絨繭蜂中的應用。8. -種培育釋放萜烯類化合物轉基因植物的方法，為將權利要求1所述的蛋白的編碼 基因導入目的植物得到轉基因植物，使轉基因植物的萜烯類化合物釋放量高于所述目的植 物。9. 一種培育抗二化螟轉基因水稻的方法，為將權利要求1所述的蛋白的編碼基因導入 目的植物得到轉基因植物，使轉基因植物的萜烯類化合物釋放量高于所述目的植物，從而 使轉基因植物的抗二化螟能力高于所述目的植物。10. 根據權利要求8或9所述的方法，所述萜烯類化合物為芳樟醇和(E)-橙花叔醇。11. 根據權利要求8或9所述的方法，所述蛋白的編碼基因具體通過權利要求5所述的重 組載體導入目的植物，所述目的植物具體為單子葉植物。12. 根據權利要求11所述的方法，所述單子葉植物為水稻。
【專利摘要】本發明涉及一種與萜烯類化合物合成相關的蛋白及其應用。本發明提供的蛋白，具有如SEQ？ID？NO2所示的氨基酸序列，編碼基因具有SEQ？ID？NO1所示的核苷酸序列。本發明的實驗證明，大腸桿菌中表達的NES1蛋白具有FPP和GPP合成活性；采用農桿菌介導法體獲得轉NES1基因水稻，結果表明轉NES1的植株可顯著吸引二化螟絨繭蜂雌蟲，為生物防治提供了一種新方法。
【IPC分類】C12N9/88, C12N15/60, C12N1/21, A01H5/00, C12P7/04, C12R1/19, C12N15/82, C12N15/70
【公開號】CN105647897
【申請號】
【發明人】王桂榮, 李峰奇, 楊婷, 劉楊
【申請人】中國農業科學院植物保護研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月4日