，然后用Omega公司的DNA回收試劑 盒按照其說明回收擴增DNA片段和載體片段。將經過雙酶切的gc基因片段連接到pET22b載 體上，16 °C過夜連接。
[0055] (5)按《分子克隆實驗指南》上制備大腸桿菌感受態的方法制備大腸桿菌DH5a感受 ??τ 〇
[0056] (6)按《分子克隆實驗指南》上的熱激轉化方法將連接好的重組pET22b載體轉至大 腸桿菌DH5a感受態。
[0057] (7)轉化的大腸桿菌DH5a涂布于含l〇〇yg/ml氨芐青霉素的LB固體培養基，37°C過 夜培養。挑選陽性克隆子，轉接至LB液體培養基中培養，提取質粒，進行Ndel/Hindll I雙酶 切，通過酶切驗證正確的質粒送北京華大基因公司測序。
[0058] 2.2重組表達載體pET22b-gc轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中
[0059] (1)按《分子克隆實驗指南》上制備大腸桿菌感受態的方法制備大腸桿菌BL21感受 態；
[0060] (2)按《分子克隆實驗指南》上的熱激轉化方法將測序正確的重組載體pET22b-gc 轉至大腸桿菌BL21感受態；
[0061 ] (3)將轉化的大腸桿菌BL21涂于含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中，37°C過夜 培養。
[0062] 2.3基因 gc在大腸桿菌中誘導表達與純化
[0063] (1)在平板上刮取大片菌苔，接于100ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養基 中，37°C培養2~3h;
[0064] (2)按1%(v/v)接種量轉接到1L)含100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C 培養至0D6QQ為0.6，加入IPTG至終濃度為0.2mM，繼續在16°C搖床培養16h;
[0065] (3)收集經過IPTG誘導表達的LB培養液，9，OOOrpm離心5min，收集菌體；
[0066] (4)用含lOOmM NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)懸浮菌體；
[0067] (5)將重新懸浮的菌液進行壓力破碎；
[0068] (6)將破碎后的菌液12，OOOrpm離心lh，收集上清液；
[0069] (7)將上清液按照說明書的要求進行鎳柱親和層析；
[0070] (8)層析后收集的樣品用SDS-PAGE檢測純度，證明已經獲得褐藻酸裂解酶GC的電 泳純酶(如圖2)。通過分子篩層析除去咪唑，最后置于-20°C保存備用。
[0071 ]實施例3:褐藻酸裂解酶GC的性質測定 [0072] 3.1最適溫度分析
[0073] 標準反應為：
[0074] 80μ1 5mg/l的褐藻酸鈉(購自 Sigma公司）底物與 100μ150ηιΜ Tris-HCl (pH 8 · 0)混 合液于20°C預熱5min后，加入20μ1稀釋好的酶液并于20°C反應30min，沸水浴5min終止反 應。測定OD235值，以不加酶液的反應作為空白對照。酶活力單位(U)定義為:一定溫度下每分 鐘產生產物使235nm處的吸收值增加0.1所需要的酶量。
[0075] 最適反應溫度的測定：以褐藻酸鈉為底物，在終濃度為25mM的Tris-HCl(pH 8.0) 緩沖液中，分別檢測褐藻酸裂解酶GC在0°C、10°C、20 °C、30 °C、40°C、50°C下的酶活。最高酶 活定義為100%。
[0076] 結果表明，30°C條件下，褐藻酸裂解酶GC酶活力最高，40°C內均較穩定，50°C左右 酶活力喪失嚴重(如圖3)。
[0077] 3.2對他(：1的耐受性分析
[0078] 向反應體系分別加入不同濃度的NaC 1，終濃度分別為0、0.2M、0.4M、0.6M、0.8M、 1.0M，分別測定不同NaCl濃度條件下的酶活，以不加 NaCl的酶活做為空白對照，將最高的酶 活定義為100%。
[0079] 結果表明該酶是耐鹽酶。GC酶活隨著鹽濃度升高而降低(如圖4)。
[0080] 3.3最適pH分析
[0081 ] 配制pH值在5 · 0~9 · 5范圍內、間隔0 · 5個pH單位的Britton-Robinson緩沖液。測定 褐藻酸裂解酶GC在30°C、不同pH條件下的酶活，最高酶活定義為100%。
[0082] 結果表明褐藻酸裂解酶C3最適pH為7.5(如圖5)。
[0083] 3.4底物特異性分析
[0084]以聚古洛糖醛酸和聚甘露糖醛酸于30°(：，2511^1^8-!1(：1(?!17.5)緩沖液中與褐 藻酸裂解酶GC分別反應，比較酶對不同底物的活性大小，分析酶的底物降解偏好性。最高酶 活定義為100%。
[0085] 結果表明該酶是對PM和PG均有酶活，是個雙功能酶。
[0086]實施例4:褐藻酸裂解酶GC的結晶 [0087] 4.1野生型褐藻酸裂解酶GC的結晶
[0088]將如上方法表達純化好的褐藻酸裂解酶GC濃縮至濃度約為10-15mg/ml，使用結晶 試劑盒（來自Hampton Research等公司的Crystal Screen Kit 1/11，Index,Salt，PEG/Ion 等)作為晶體生長的初篩條件，采用懸滴氣象擴散法進行結晶。本發明在多個不同的結晶試 劑條件下獲得了初始晶體。采用座滴氣相擴散法優化初始晶體生長條件，優選l〇〇mM SPG， pH 8.5，25%PEG1500的緩沖液作為晶體生長條件，收集到一套分辨率為2.2 A的X射線衍射 數據。
[0089] 4.2硒代甲硫氨酸褐藻酸裂解酶GC的誘導表達及純化
[0090] (1)重組表達載體pET22b-gc轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)如2.2所述。
[0091] (2)在平板上刮取大片菌苔，接于含100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C 培養過夜；
[0092] (3)取10ml菌液接到含100μg/ml氨芐青霉素的520ml的適應培養基中，37°C培養到 0D 0.6-0.8；
[0093] (4)將細胞從適應培養基中分離出來，4000rpm，4 °C離心1 Omin;
[0094] (5)倒掉上清，用三蒸水洗滌沉淀，4000rpm，4 °C離心1 Omin;
[0095] (6)棄去上清，用120ml三蒸水重懸；
[0096] (7)向1L(含100μg/ml氨芐青霉素的表達培養基中事先加入L-Lys，L-Tyr，L-Phe各 10011^及1^-1^11兒-116兒-￥31各5011^。再向其中加入201111的重懸菌液。37°(：培養到00 0.6-0.8；
[0097] (8)降溫至20°C45min，向每升表達培養基中加入50mg L-Se-Met，再加入IPTG至終 濃度為 〇.21^，20°(：，120印111培養1611;
[0098] (9)純化方法如2.3中所述。
[0099] 上述適應培養基組分如下：
[0100] 80ml 5XM9，120ml 20wt%葡萄糖，80ml LB，240ml蒸饋水。
[0101] 上述表達培養基組分如下：
[0102] 200ml 5XM9,260ml 20wt%葡萄糖，100ml 6.5wt%的YNB，440ml蒸餾水。
[0103] 上述5XM9組分如下：
[0104] 8 · 6wt %十二水和磷酸氫二鈉，1 · 5wt %磷酸二氫鉀，0 · 25wt %氯化鈉，0 · 5wt %氯 化銨，蒸餾水配制。
[0105] 4.3硒代甲硫氨酸褐藻酸裂解酶GC的結晶
[0106] 結晶方法如4.1。本發明在多個不同的結晶試劑條件下獲得了初始晶體。通過后期 的優化調整，優選0.2M丙二酸鈉 ，pH 7.0，20 %PEG3350的緩沖液作為晶體生長條件，收集到 一套分辨率為2.9 A的X射線衍射數據。
[0107] 實施例5.褐藻酸裂解酶GC的數據收集及結構解析
[0108] 本發明將制備的晶體以20 %的甘油作為防凍劑處理后，凍存于液氮中。晶體X射線 衍射的數據收集在上海光源（SSRF)生物大分子晶體學光束線站BL17U進行。數據處理使用 的是HKL2000。結構的相位信息通過硒的多波長反常散射(SAD)獲取。重金屬原子位置通過 hkl2map尋找，結構的初步解析通過Phenix. autosol和Phenix. autobuild程序完成。然后利 用Phenix. refine程序并輔以Coot軟件對初始結構做進一步修正，最終解析得到褐藻酸裂 解酶GC的晶體結構。
[0109] 該褐藻酸裂解酶GC為多糖裂解酶6家族首次解析的褐藻酸裂解酶結構，也是除果 膠酶、硫酸軟骨素裂解酶B，多糖裂解酶中首次證實的拓撲結構為右手β螺旋的褐藻酸裂解 酶。
【主權項】
1. 一種海洋褐藻酸裂解酶基因 gc，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 權利要求1所述海洋褐藻酸裂解酶基因 gc編碼的海洋褐藻酸裂解酶GC，氨基酸序列 如SEQ ID NO .2所示。3. -種重組表達載體，該表達載體包含有如SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的功能片段。4. 一種重組細胞，該宿主菌中轉化有權利要求3所述重組表達載體或表達權利要求2所 述的海洋褐藻酸裂解酶GC。5. 權利要求2所述海洋褐藻酸裂解酶GC和/或權利要求1所述海洋褐藻酸裂解酶基因 gc 在褐藻酸裂解中的應用。
【專利摘要】本發明涉及一種海洋褐藻酸裂解酶及其表達基因與應用。一種海洋褐藻酸裂解酶基因gc，核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，所述海洋褐藻酸裂解酶基因gc編碼的海洋褐藻酸裂解酶GC，氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本發明首次獲得了褐藻酸裂解酶GC，并利用結晶的方法得到了褐藻酸裂解酶GC的晶解析了其三維結構。褐藻酸裂解酶GC晶體結構可在工業酶制劑中的底物改造、提高酶活等方面具有廣泛的應用前景。
【IPC分類】C12N15/70, C12R1/19, C12N15/60, C12P19/00, C12N9/88, C12N1/21
【公開號】CN105647898
【申請號】
【發明人】陳秀蘭, 張玉忠, 徐菲, 董方, 李平一, 張熙穎, 蘇海楠, 周百成
【申請人】山東大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月9日