2:1，v/v)進行萃取分離，靜 置分層后取有機相層，用有機相層體積1/2的去離子水將有機相洗滌5次，洗滌過的有機相 層30°C旋轉蒸發除去氯仿，即獲得琥珀酰亞胺基接枝的碳納米管；
[0095] (2)在45°C、200r/min條件下，在裝有回流裝置的反應器中，加入2g N，N-二(羧基 甲基)-L-賴氨酸水合物、8g三乙胺和80g二甲基甲酰胺，加熱回流lOOrnin，在45°C、450r/min 條件下，將13g琥珀酰亞胺基接枝的碳納米管加入到反應器中，反應5h，將反應液lOOOOr/ min離心，沉淀用6倍沉淀物體積的二甲基甲酰胺洗滌3次，放入35°C真空干燥箱干燥即得表 面氨基三乙酸功能化的碳納米管；
[0096] (3)將步驟(2)獲得的表面氨基三乙酸功能化的碳納米管加入到9% (w/v)的氯化 銅溶液中，碳納米管濃度為8% (w/v)，室溫條件下，130轉/分攪拌反應55min，經離心分離、 水洗滌后獲得銅離子鰲合修飾的碳納米管；
[0097] (4)將漆酶加入到含0.4g/L乙二胺四乙酸二鈉的一元醇-水混合物中，漆酶的濃度 為4g/L，一元醇-水混合物中含水7%，16°C、200r/min條件下，攪拌反應80min，反應液 10500r/min離心28min，含水7%的一元醇-水混合物洗滌3次，所得產物即為脫除銅離子的 漆酶；
[0098] (5)以步驟(3)得到的銅離子鰲合修飾的碳納米管作為載體與分散于pH2含水7% 的異丙醇-水混合物中的〇.4g/L步驟(4)得到脫除銅離子漆酶混合，碳納米管濃度7g/L，在 室溫條件下，180r/min攪拌反應35min，經離心、pH3.8的緩沖液洗滌后，獲得碳納米管固定 化漆酶。
[0099]固定化酶特性的測試：
[0100]基于直接電子傳遞的碳納米管固定化漆酶的漆酶負載量為55mg(漆酶)/g(碳納米 管)酶活回收率為91%，與同等碳納米管載體固定等量含銅天然漆酶相比，其他應用條件一 致的情況下，其應用于酚類測定時的最低檢測限降低96%，其應用于生物燃料電池時的電 流密度提高120 %。
[0101] 實施例6
[0102] (1)在室溫(約25°C)條件下，將28鹵代琥珀酰亞胺溶于80g丙酮，將3g碳酸鉀、4g焦 亞硫酸鉀、20g羧基化碳納米管在160g水中充分混合至無機鹽完全溶解，將丙酮溶液與水溶 液混合，38°C，400r/min攪拌35min，加入360g氯仿-水的混合物(2:1，v/v)進行萃取分離，靜 置分層后取有機相層，用有機相層體積1/2的去離子水將有機相洗滌4次，洗滌過的有機相 層36°C旋轉蒸發除去氯仿，即獲得琥珀酰亞胺基接枝的碳納米管；
[0103] (2)在40°C、230r/min條件下，在裝有回流裝置的反應器中，加入2g N，N-二(羧基 甲基）-L-賴氨酸水合物、9g三乙胺和90g二甲基甲酰胺，加熱回流88min，在50°C、400r/min 條件下，將15g琥珀酰亞胺基接枝的碳納米管加入到反應器中，反應5h，將反應液9000r/min 離心，沉淀用7倍沉淀物體積的二甲基甲酰胺洗滌3次，放入37°C真空干燥箱干燥即得表面 氨基三乙酸功能化的碳納米管；
[0104] (3)將步驟(2)獲得的表面氨基三乙酸功能化的碳納米管加入到8.5% (w/v)的氯 化銅溶液中，碳納米管濃度為7.5% (w/v)，室溫條件下，180轉/分攪拌反應32min，經離心分 離、水洗滌后獲得銅離子鰲合修飾的碳納米管；
[0105] (4)將漆酶加入到含0.25g/L乙二胺四乙酸二鈉的一元醇-水混合物中，漆酶的濃 度為2.5g/L，一元醇-水混合物中含水8 %，13 °C、260r/min條件下，攪拌反應90min，反應液 13000r/min離心23min，含水8%的一元醇-水混合物洗滌3次，所得產物即為脫除銅離子的 漆酶；
[0106] (5)以步驟(3)得到的銅離子鰲合修飾的碳納米管作為載體與分散于PH2含水8% 的異丙醇-水混合物中的〇.5g/L步驟(4)得到脫除銅離子漆酶混合，碳納米管濃度9g/L，在 室溫條件下，190r/min攪拌反應30min，經離心、pH3.3的緩沖液洗滌后，獲得碳納米管固定 化漆酶。
[0107] 固定化酶特性的測試：
[0108] 基于直接電子傳遞的碳納米管固定化漆酶的漆酶負載量為65mg(漆酶)/g(碳納米 管)酶活回收率為92%，與同等碳納米管載體固定等量含銅天然漆酶相比，其他應用條件一 致的情況下，其應用于酚類測定時的最低檢測限降低95%，其應用于生物燃料電池時的電 流密度提高115 %。
[0109] 申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細工藝設備和工藝流程， 但本發明并不局限于上述詳細工藝設備和工藝流程，即不意味著本發明必須依賴上述詳細 工藝設備和工藝流程才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進， 對本發明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的 保護范圍和公開范圍之內。
【主權項】
1. 一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，采用以下步驟制備： 一、 碳納米管的表面功能化 1 )、將碳納米管進行琥珀酰亞胺基的接枝； 2)、將步驟1)得到的琥珀酰亞胺基接枝的碳納米管進行氨基三乙酸功能團的接枝； 3 )、將步驟2)得到的碳納米管進行銅離子鰲合修飾； 二、 對漆酶進行脫銅離子處理； 三、 將表面功能化的碳納米管和脫除銅離子的漆酶混合，在室溫條件下攪拌，進行漆酶 固定化反應，然后經離心分離、洗滌后獲得碳納米管固定化漆酶。2. 如權利要求1所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，所述碳納米管進行氨基 三乙酸功能團接枝的方法為： 1) 、接枝反應溶液的制備 將N，N-二（羧基甲基)-L-賴氨酸水合物和三乙胺加入到二甲基甲酰胺中，攪拌加熱回 流使二者完全溶于二甲基甲酰胺中； 2) 、將琥珀酰亞胺基接枝的碳納米管放入接枝反應溶液中，攪拌加熱回流，接枝反應結 束后離心、洗滌、干燥，獲得表面氨基三乙酸功能化的碳納米管。3. 如權利要求2所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，所述接枝反應溶液包括 1重量份的N，N-二(羧基甲基)-L-賴氨酸水合物、2~6重量份的三乙胺和20~60重量份的二 甲基甲酰胺。4. 如權利要求2-3任一項所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，接枝反應的溫 度為30~60°C，攪拌速度為300~600r/min，反應時間為3~6h。5. 如權利要求1所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，對漆酶進行脫銅離子處 理的方法為:將漆酶加入到含有乙二胺四乙酸二鈉的一元醇和水的混合溶液中，攪拌反應 后離心，洗滌，收集沉淀，得到脫除銅離子的漆酶。6. 如權利要求5所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，所述的一元醇為C1-C4 的直鏈或支鏈烷基一元醇中的任意1種或幾種的組合;所述一元醇和水的混合物中水的含 量為3-10% (v/v);乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0.1-0.5g/L。7. 如權利要求5或6任一項所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，脫除銅離子 的反應溫度為10~20°C，攪拌速度為100~300r/min，反應時間為60-120min。8. 如權利要求1所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，所述碳納米管進行琥珀 酰亞胺基的接枝的方法為： 1) 、將1重量份的鹵代琥珀酰亞胺完全溶解于15~45重量份的丙酮； 2) 、將0.5~2重量份碳酸鉀、1~2.5焦亞硫酸鉀、3~12份羧基化碳納米管在30~90重 量份的水中充分混合至無機鹽完全溶解； 3) 、將1)與2)溶液混合，在20~40 °C下，攪拌速率為300-1000r/min，反應20-40min; 4) 、加入氯仿與水進行萃取分離，然后經洗滌、旋轉蒸發得到琥珀酰亞胺基接枝碳納米 管。9. 如權利要求1所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，所述當的碳納米管為羧 基化的碳納米管，每克碳納米管上漆酶負載量為40~80mg。10. 如權利要求1所述的碳納米管固定化漆酶用于生物檢測和電化學分析、生物燃料電 池、環境污染物的降解和染料脫色、有機合成、廢水處理。
【專利摘要】本發明公開了一種碳納米管固定化漆酶，其制備方法為先將碳納米管進行琥珀酰亞胺基的接枝和氨基三乙酸功能團的接枝，再進行銅離子鰲合修飾的表面功能化處理，然后與脫除銅離子的漆酶進行固定化反應；漆酶活性中心與碳納米管表面功能基團的銅離子直接聯接，從而可以實現真正意義的直接電子傳遞，克服了漆酶蛋白質外殼對電子由活性中心到碳納米管的直接傳遞過程產生的屏蔽作用，本發明的碳納米管固定化漆酶解決了碳納米管固定化漆酶催化過程中電子傳遞速率受限的問題，可提高固定化漆酶在生物檢測中的靈敏度，將酚類測定時的最低檢測限降低85％～96％，在生物燃料電池應用中的電流密度提高80％～120％。
【IPC分類】C12N11/14
【公開號】CN105647902
【申請號】
【發明人】王 鋒, 徐玲
【申請人】江蘇大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月30日