一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組dna的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法，屬于分子生物 學技術領域。
【背景技術】
[0002] 基因組DNA提取是開展分子生物學研究的一項重要技術環節，并被廣泛地應用于 種質資源評價及育種研究，為便于查找動物的血緣關系和管理記錄，在動物出生后往往采 用剪耳缺法對每個個體進行編號，此時采集耳缺組織可滿足大樣本量的研究且不傷害的動 物健康。目前從哺乳動物組織中提取基因組DNA的方法通常采用傳統的酚-氯仿抽提法和試 劑盒法，前者在組織破碎后直接進行蛋白酶K消化處理，耗時長（2 12h)，細胞破碎不充分； 后者價格昂貴，且由于耳組織含有少量被毛，難消化，DNA提取濃度低，因此均不適用于大樣 本量研究的提取。面對大量的研究個體和樣本，快速、高效的耳組織基因組DNA提取方法將 有利于提尚研究效率。
【發明內容】
[0003] 本發明所要解決的技術問題是針對現有基因組DNA提取方法存在的DNA提取濃度 低或耗時長等缺陷，提供一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法。
[0004] 本發明采用以下技術方案： 一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法，該方法的具體步驟如下： 1) 組織破碎:取組織樣于滅菌離心管中，剪碎;快速加入預冷的TE裂解液，盡可能使細 胞充分破碎制成溶漿并對溶漿中DNA進行保護； 2) 組織裂解液消化； 3) Tris飽和酚抽提； 4) Tr is飽和酚和氯仿異戊醇混合抽提； 5) 氯仿異戊醇抽提； 6) 醋酸鈉和-20°C預冷的無水乙醇沉淀DNA; 7) 乙醇漂洗； 8 )TE緩沖液溶解DNA、保存。
[0005] 步驟1)中所述TE裂解液的組成為:pH8.0的10mM Tris-HCl和pH8.0的2mM EDTA。
[0006] 本發明的優點在于:在組織剪碎后快速加入預冷的TE裂解液，通過其成分中稍高 的EDTA組分濃度抑制脫氧核酸酶對DNA的降解作用，顯著提高了DNA的得率(DNA濃度112~ 851 ng/yL，TE成分中ImM EDTA組份濃度時提取的DNA濃度40~160 ng/VL)，并結合預冷的 緩沖體系保護了DNA的完整性;Tris-飽和酚反復抽提有效去除蛋白質，節省了在消化過程 中加蛋白酶K消化蛋白質的時間（2 12h)，本發明提取DNA過程耗時約3h。
【附圖說明】
[0007] 圖1為本發明提取的哺乳動物耳組織基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖； 圖2為現有技術的TE緩沖液成分中ImM EDTA (pH8.0)組份濃度時提取的哺乳動物耳組 織基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖； 電泳條件：1 yL DNA提取樣品與1.0 yL 6 X Buffer上樣緩沖液混勻，加樣于1.0%的 瓊脂糖凝膠，100 V電壓，電泳30 min。
[0008] 圖1中的基因組DNA條帶清晰明亮，沒有降解，即該方法提取的DNA完整性好、質量 高。圖2中的基因組DNA明顯不如圖1的清晰明亮，有輕微的拖帶現象，說明有DNA降解。
【具體實施方式】
[0009] 下面對本發明及其效果作進一步說明。
[0010] 一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法，該方法的具體步驟如下： 1) 組織樣在滅菌離心管中剪碎后快速加入預冷的TE，使細胞充分破碎并對溶漿中DNA 進行保護； 2) 組織裂解液消化省去了加蛋白酶K消化過夜的操作； 3) Tris-飽和酚抽提； 4) Tr is-飽和酚和氯仿異戊醇混合抽提； 5) 氯仿異戊醇抽提； 6 )醋酸鈉 (NaAc )和-20 °C預冷的無水乙醇沉淀DNA; 7) 乙醇漂洗； 8) TE溶解DNA、保存。
[0011]
【具體實施方式】如下： 1)TE裂解液配制（pH 8.0):1M Tris-HCl (pH8.0) 5 mL，0.5M EDTA (pH8.0) 2 mL， 加 ddH2〇定容至500 mL，高壓滅菌。
[0012] 2)組織裂解液配制：1M Tris. HC1 (pH 8.0)25 mL，0.5M EDTA 100 mL，2M NaCl 25 mL，10% SDS 50 mL，加 ddH20定容至500 mL，高壓滅菌。
[0013] 3)取約30 mg仔豬耳組織樣，裝入1.5 mL滅菌離心管，用手術剪刀剪碎(剪完每一 樣品所用的鑷子和手術剪刀都要用酒精棉球擦洗，以除去殘留的組織樣;并等待至酒精完 全揮發）； 4) 加入300 yL充分預冷至-20°C的TE裂解液，反復顛倒離心管5 min，3000 rmp離心5 min、棄上清液； 5) 加入600 yL組織裂解液，緩慢顛倒混勻10 min; 6) 加入600 yL Tris飽和酚，緩慢顛倒混勻10 min，12000 rpm離心10 min，吸取上層清 液； 7) 重復步驟4)操作； 8) 加入300 yL Tris飽和酚和300 yL氯仿/異戊醇（24:1體積比），緩慢顛倒混勻10 min，12000 rmp離心10 min，吸取上清夜； 9) 加入600 yL氯仿/異戊醇(24:1)，混勾10 min，12000 rpm離心10 min，吸取上清夜； 10) 加入60 yL 3 M NaAc和在-20 °C充分預冷的無水冰乙醇1 mL，輕微搖晃至出現 乳白色絲狀DNA沉淀，冰浴15 min，12000 rmp離心10 min，棄上清液； 11) 加入1 mL 75%乙醇漂洗，12000 rpm離心2 min，棄上清液； 12) 小心倒掉乙醇，將離心管倒扣與濾紙上，置于無菌操作臺，至乙醇揮發完全； 13) 加入200 yL TE緩沖液，4 °C放置24 h使DNA完全溶解，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分 光光度計檢測后-20 °C保存。
[0014] 步驟1)中所述TE裂解液的組成為10mM Tris-HCl (PH8.0)和2mM乙二胺四乙酸 (EDTA，pH8 · 0)。Tris的作用是緩沖體系的pH，而EDTA可以螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制脫 氧核酸酶對DNA的降解作用，為了保證裂解體系的pH并抑制核酸酶，該TE裂解液在EDTA組份 濃度上稍高于溶解DNA的TE緩沖液濃度，該對比效果見表1、2。
[0015] 表1為本發明提取的哺乳動物耳組織基因組DNA濃度和純度經ND-1000型紫外分 光光度儀檢測結果； 表1
表2為現有技術的TE緩沖液成分中ImM EDTA (pH8.0)組份濃度時提取的哺乳動物耳組 織基因組DNA濃度和純度經ND-1000型紫外分光光度儀檢測結果； 表2
基因組DNA的質量濃度以及在波長260 nm和280 nm處吸收值的比值(OD260/280)分別反 應基因組DNA的濃度和純度。質量較好的DNA其0D26Q/28(x)值在1.7~1.9之間，比值大于1.9表 示DNA溶液中有RNA存在，由于RNA易降解，對動物遺傳資源評價及育種的研究不會產生影 響。表1中提取出的基因組DNA質量濃度明顯高于表2的方法中提取的基因組DNA濃度，說明 本發明方法提取的基因組DNA得率高。
[0016] 步驟1)中所述TE裂解液應在-20°c預冷至少30 min，對溶漿中DNA實施低溫保護。 [0017]步驟1)中所述TE裂解液體積為300 yL，以確保徹底裂解樣品，同時使裂解體系中 核酸濃度適中。由于核酸濃度低導致沉淀效率低，影響DNA得率;濃度過高，會使去除雜質的 過程復雜且不徹底，導致DNA純度下降。
[0018] 步驟2)中所述的組織裂解液組成為1M Tris-HCl (PH8.0) 25 mL、0.5M EDTA 100 mL、2M NaCl 25 mL、10% SDS 50 mL、ddH20 300 mL。
[0019] 步驟3)中所述的Tris-飽和酚抽提操作進行了2次。酚是很強的蛋白質變性劑， Tris-飽和酚反復抽提，能使變性的蛋白質溶解在其中，達到有效去除蛋白質的目的，節省 了消化過程中加蛋白酶K消化蛋白質的時間（2 12h)。
[0020] 步驟7)中所述乙醇濃度為75%，以很好的洗去加入的鹽，避免了乙醇濃度太高達不 到脫鹽效果和濃度太低使DNA溶解對提取效果的影響。
【主權項】
1. 一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法，其特征在于:該方法的具體步 驟如下： 1) 組織破碎:取組織樣于滅菌離心管中，剪碎;快速加入預冷的TE裂解液，盡可能使細 胞充分破碎制成溶漿并對溶漿中DNA進行保護； 2) 組織裂解液消化； 3 )Tr is飽和酚抽提； 4. Tris飽和酚和氯仿異戊醇混合抽提； 5) 氯仿異戊醇抽提； 6) 醋酸鈉和-20°C預冷的無水乙醇沉淀DNA; 7) 乙醇漂洗； 8. TE緩沖液溶解DNA、保存。2. 根據權利要求1所述的一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法，其特征 在于:步驟1)中所述TE裂解液的組成為:pH8.0的10mM Tris-HCl和pH8.0的2mM EDTA。3. 根據權利要求2所述的一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法，其特征 在于:所述TE裂解液的體積為300yL。4. 根據權利要求2所述的一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法，其特征 在于:所述TE裂解液應在-20°C預冷至少30 min。5. 根據權利要求1所述的一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法，其特征 在于：步驟2)中所述的組織裂解液組成為：pH8.0的1M Tris-HCl 25 mL、0.5M EDTA 100 mL、2M NaCl 25 mL、10% SDS 50 mL、ddH20 300 mL。6. 根據權利要求1所述的一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法，其特征 在于:步驟3)中所述的Tris-飽和酚抽提2次。7. 根據權利要求1所述的一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法，其特征 在于：步驟7)中所述乙醇濃度為75%。
【專利摘要】本發明公開了一種快速高效提取哺乳動物耳組織基因組DNA的方法包括：1）組織破碎和DNA保護；2）組織裂解液消化；3）Tris-飽和酚抽提；4）Tris-飽和酚和氯仿異戊醇混合抽提；5）氯仿異戊醇抽提；6）NaAc和充分預冷（-20℃）的無水乙醇沉淀DNA；7）乙醇漂洗；8）TE緩沖液溶解DNA、保存。本發明顯著提高了DNA的得率（DNA濃度112~851ng/μL），同時節省了DNA提取時在破碎細胞后加蛋白酶K進行消化過夜（≥12h）的時間，從組織破碎到基因組DNA提取完成總耗時約3h。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105647911
【申請號】
【發明人】滾雙寶, 馬艷萍, 楊巧麗
【申請人】甘肅農業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年4月8日