基于雙磁珠法免離心提取質粒dna的試劑盒及使用方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的 試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002] DNA是基本的遺傳物質，在蛋白質合成和一系列重大生命的生長和變異過程中起 著決定性作用。以DNA為研究對象的生物技術，包括對DNA的提取、克隆、擴增、測序等一系列 技術，近年得到飛速發展。在基因工程各項研究中，質粒DNA起著重要作用，為影響下游DNA 研究能否成功的重要因素之一，因此對細菌質粒DNA進行提純非常重要。
[0003] 大多數質粒DNA提取方法一般都包括細胞裂解、去除與核酸結合的物質、沉淀核 酸、去除鹽類、有機溶劑等雜質、純化分離質粒DNA等步驟。傳統方法主要是CTAB法和離心柱 法。由于傳統方法步驟繁瑣、耗時，并且用到氯仿、苯酚等毒性大的有機溶劑，污染較大，易 導致核酸降解;離心柱法雖不使用有機溶劑，卻還是不能免除離心過濾等繁瑣的操作步驟， 不易實現自動化，難以進行高通量提取。采用磁珠為載體的分離技術，無需接觸有毒試劑且 操作簡便，容易實現自動化，短時間就能實現樣本DNA的快速、高質量的提取，是未來高通量 核酸提取的重要發展方向，具有傳統DNA提取方法無法比擬的優勢。但是傳統的磁珠法依然 需要離心步驟，不適合高通量化自動化提取細菌質粒DNA的發展方向。
[0004] 綜述所述，現有磁珠法提取細菌質粒DNA的技術不能滿足無需離心、高通量化、自 動化的技術問題，所以需要開發一種更為快捷、簡便、全程無離心步驟可適用于高通量、自 動化的磁珠法提取細菌質粒DNA的提取方法。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術存在的不足，本發明的目的在于提供了一種基于雙磁珠法免離心提 取質粒DNA的試劑盒及使用方法。提取的質粒DNA純度高、片段完整，提取過程方便快捷，適 合高通量、自動化提取。
[0006] 為實現上述目的，本發明通過以下技術方案實現：
[0007] 一種基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其包括有分別獨立分裝的除雜 磁珠懸浮液、提取磁珠懸浮液、細菌裂解液、結合緩沖液、清洗液和洗脫液；
[0008] 其中，所述除雜磁珠懸浮液中分散有除雜磁珠，所述除雜磁珠表面至少修飾有苯 乙烯、二乙烯基苯和亞氨基二乙酸；
[0009] 所述提取磁珠懸浮液中分散有提取磁珠，所述提取磁珠表面修飾有娃羥基。
[0010] 優選的是，所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其中，所述除雜磁 珠懸浮液包括有3 - 6 m g / m L的除雜磁珠和第一分散液，所述第一分散液包括有1- 3 Μ的無機 酸、2-4Μ的金屬鹽、0.02-0.05Μ的Tris-HCl緩沖液和0.1-0.2mg/mL的RNA酶;所述無機酸選 自硫酸、鹽酸、硝酸或其組合;所述金屬鹽選自碳酸鉀、醋酸鉀、碳酸鈉、醋酸鈉或其組合。 [0011]優選的是，所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其中，所述提取磁 珠懸浮液包括有40-60mg/mL的提取磁珠和第二分散液，所述第二分散液包括有0.1-0.5M的 氯化鈉;且所述第二分散液的pH為5.0-7.4。
[0012] 優選的是，所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其中，所述細菌裂 解液包括0.2-1.5M的氫氧化鉀、0.15-0.5wt %的十二烷基硫酸鈉和0.01-0.025M的乙二胺 四乙酸。
[0013] 優選的是，所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其中，所述結合緩 沖液包括0.01-0.03M的尿素、0.08-0.15M的醋酸鈉、0.2-lwt %的β-巰基乙醇、4-6.5M的第 一變性劑，所述第一變性劑選自鹽酸胍、異硫氰酸胍、碘化鉀、碘化鈉或其組合。
[0014] 優選的是，所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其中，所述清洗液 包括38-72wt%的異丙醇，0.8-1.6Μ的第二變性劑，所述第二變性劑選自鹽酸胍、異硫氰酸 胍、碘化鉀或其組合。
[0015] 優選的是，所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其中，所述洗脫液 包括0.005-0.02M的Tris-HCl緩沖液和0.001-0.005M的乙二胺四乙酸。
[0016] 優選的是，所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其中，所述除雜磁 珠的制備方法如下：
[0017] S1:將1-5份的包裹Si02的四氧化三鐵納米磁球加入到含800份乙醇和200份水的 混合體系中，加入〇. 1-1份三乙胺，在惰性氣體保護下，升溫至40-80°C，隨后加入0.5-5份硅 烷偶聯劑KH570(KH570的中文名：γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷），攪拌反應4-6小 時，經清洗干燥后，得到修飾有ΚΗ570的磁珠；
[0018] S2:取1-5份修飾有ΚΗ570的磁珠加入到1000份DMSO溶液中，加入0.5-1份的苯乙 烯、0.2-1份的二乙烯基苯、1-2份的丙烯醇和0.05份的偶氮二異丁腈，升溫至60-85Γ，惰性 氣體保護下，攪拌反應4-6小時，加入0.5-1.5份的甲基丙烯酸縮水甘油酯，繼續攪拌反應 12-16小時，經洗滌干燥后，得到改性磁珠。
[0019] S3:取1-5份所述改性磁珠分散到1000份的含有0.2Μ的碳酸鈉水溶液中，加入1-3 份的亞氨基二乙酸，反應2-4小時，經洗滌干燥后，即得到除雜磁珠。
[0020] 優選的是，所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其中，所述提取磁 珠的粒徑為100-2000nm〇
[0021] 除雜磁珠通過在包裹Si02的四氧化三鐵納米磁球外修飾雙鍵，然后加入苯乙烯、 二乙烯基苯、丙烯醇、甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚而成，然后通過接枝亞氨基二乙酸從而制 備而成。苯乙烯、二乙烯基苯的修飾可以保證磁珠不會吸附核酸，而亞氨基二乙酸可以選擇 性螯合二價離子，比普通離子交換劑具有更高的金屬離子選擇性和較強的結合力，能結合 許多可能影響進一步分析的其他外源物質，除雜磁珠可以將蛋白、脂類、糖類、裂解后的細 胞壁等雜質吸附并除去而不會影響核酸的提取，從而避免離心過程。
[0022] -種如上述任一項所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒的使用方 法，其包括：
[0023] 步驟1)菌液準備:取細菌培養液1.0-2.0份，轉移到孔板中，并記錄；
[0024] 步驟2)菌體裂解:向孔板中加入0.1-0.2份的細菌裂解液，混勻；
[0025] 步驟3)質粒復性：向孔板中加入0.2-0.4份的除雜磁珠懸浮液，混勻；
[0026] 步驟4)去除菌體基因組和蛋白：磁性分離棄去除雜磁珠及其吸附物，保留孔板中 澄清透明的菌液；
[0027]步驟5)質粒DNA結合：向菌液中加入0.5-1.5份的結合緩沖液以及0.03-0.08份的 提取磁珠懸浮液，混勻，磁性分離，去除上層清液；
[0028]步驟6)清洗:向孔板中加入0.4-0.8份清洗液，混勻，磁性分離，去除上層清液； [0029]步驟7)除醇和洗脫：將上述含有提取磁珠的孔板放入40°C的真空干燥箱干燥5-lOmin，隨后加入0.04-0.1份的洗脫液，混勻，磁性分離去除磁珠，在孔板的洗脫液中即含有 目標質粒DNA。
[0030] 本發明的有益效果是：
[0031] 1、本發明通過開發一種除雜磁珠在菌體裂解之后，將細胞壁、蛋白等雜質去除而 保留上清液中的質粒DNA，從而替代了傳統過程中的離心步驟，更為高效快捷。
[0032] 2、本發明開發的質粒DNA提取試劑盒提取方法可以預先將緩沖液、磁珠懸浮液等 分裝于相應的核酸提取儀器中的孔板中，滿足自動化、高通量的需求。
[0033] 3、本發明通過除雜磁珠先一步除雜，提取磁珠進一步結合富集，提取的質粒DNA純 度高、片段完整。
【附圖說明】
[0034]圖1是本發明的試劑盒提取質粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中1-4分別是實施例 2-5提取的質粒DNA條帶，a-h是每個實施例平行試驗所提取的質粒DNA條帶。
【具體實施方式】
[0035] 下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文 字能夠據以實施。
[0036] 實施例1:除雜磁珠的制備步驟如下：
[0037] SI: l-5g的包裹Si02的四氧化三鐵納米磁球加入到800mL乙醇和200mL水的混合體 系中，加入0.1-lg三乙胺，氮氣保護下，升溫至40~80°C加入0.5-5g KH570，機械攪拌反應6 小時，用去離子水和乙醇清洗三次后干燥，得到修飾KH570的磁珠；
[0038] S2: l-5g修飾KH570的磁珠，加入到lOOOmL DMS0溶液中，加入0.5-lg的聚乙烯， 0.2-]^的二乙烯基苯，1-28的丙稀醇，加入5〇11^的偶氮二異丁腈，升溫至6〇-85<€，氮氣保護 下反應4-6小時，加入0.5-1.5g的甲基丙烯酸縮水甘油酯，機械攪拌繼續反應12-16小時，用 去離子水和乙醇清洗三次后干燥，得到改