一種固定化糖化酶及酵母同步糖化發酵木薯生產乙醇的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于發酵工程技術領域，涉及一種固定化糖化酶及酵母同步糖化發酵木薯生產乙醇的方法，提供一種以木薯為原料，利用固定化糖化酶及酵母生產乙醇的方法。通過使用本發明公開的特殊的固定化劑，取得了縮短發酵時間、提高了發酵效率。
【背景技術】
[0002]在現有技術中固定化細胞發酵具有能使發酵罐內細胞濃度提高，細胞可連續使用，最終使發酵液酒精濃度得以提高。在游離發酵過程中，菌種細胞隨著酵液流出，造成菌種細胞濃度迅速降低，發酵速度變慢。
[0003]目前研究比較廣泛的是采用聚乙烯醇(PVA)為載體共固定化酵母菌細胞和糖化酶，在酵母菌與糖化酶共固定化木薯酒精連續發酵工藝研究中，以木薯糖化醪液為發酵底物，在共固定化生物反應器中，控制發酵溫度30°C，在糖化醪流加速率為9mL/h，停留時間
3.1h和稀釋速率為0.155h-l條件下進行酒精連續發酵，成熟發酵醪液殘余總糖和殘余還原糖含量均較低，游離細胞數較常規發酵低I個數量級以上，總糖利用率高達96.91%。
[0004]共固定化酵母菌細胞和糖化酶可用于木薯酒精連續發酵工藝，但聚乙烯醇存在有危險性，當吸入、攝入或經皮膚吸收聚乙烯醇后對身體有害，對眼睛和皮膚有刺激作用，而且聚乙烯醇可燃，具有刺激性，其粉體與空氣可形成爆炸性混合物，當達到一定濃度時，遇火星會發生爆炸，加熱分解產生易燃氣體。
[0005]綜上所述說明聚乙烯醇不適合在木薯酒精連續發酵工藝中大規模應用。
[0006]中國專利CN103484504A，于2014年I月I日公開了一種以木薯為原料發酵制備乙醇的方法，其中酵母菌的固定化采用海藻酸鈉溶液。該方法包括木薯液化、糖化、固定化酵母發酵、蒸餾提取乙醇的步驟，所述木薯液化是將木薯粉碎后加水攪勻，按照5U/g?10U/g木薯的比例添加淀粉酶，在96°C?98°C下液化20min?30min,得到液化衆液；
[0007]所述糖化是將木薯液化得到的漿液真空降溫至58°C?62°C，采用注射方式加入硫酸調節pH = 4.5?5.0,再按照150U/g?200U/g木薯的比例往木薯液化漿液中加入糖化酶保溫糖化40min?50min,得到糖化醪；
[0008]所述固定化酵母發酵是向糖化醪中接種經固定化的酵母菌，其用量以酵母菌計，為木薯重量的0.5%。?1%。，在38°C?40°C下發酵9h?llh，收集流出液。
[0009]所述的以木薯為原料發酵制備乙醇的方法，其中酵母菌的規定化方法為:將活化酵母與2?%的海藻酸鈉溶液混勻后用注射器逐滴滴加到2?%的氯化鈣溶液中，反應2小時，形成海藻酸鈣凝膠顆粒；再將海藻酸鈣凝膠顆粒水洗后移入到2w%的氯化鈣溶液中，在4°C下平衡12小時，用蒸餾水洗滌3次后，移入到1?%的硫酸鋁溶液中，在4°C下交換12小時，得到海藻酸鋁凝膠顆粒。
[0010]該專利所選擇的高分子載體為海藻酸鋁，具有價格便宜，制備簡單，安全無毒、擴散系數大，機械強度好，固定化條件溫和等優點，同時具有很強的耐鹽能力，尤其是耐磷酸鹽的能力，選用海藻酸鋁合凝膠固定化酵母菌能明顯延長固定化酵母的使用壽命，降低生產成本。
[0011]中國專利CN103571880A，于2014年2月12日公開了一種利用甜菜生產燃料乙醇的方法，其中酵母細胞的固定化采用海藻鈉和聚乙烯醇，該方法包含有:
[0012]A、制備玉米漿液:1L水中加入30g玉米粉，加熱為(90±2) °C，加入α -淀粉酶液化35min,冷卻降溫至(55 ± 2) °C,加入糖化酶糖化50min ；
[0013]B、制備固定化酵母細胞活化增殖培養基:葡萄糖2O g，玉米漿液3OmI，硫酸銨0.5g，磷酸二氫鉀0.02g，硫酸亞鐵0.003g，加水至1000ml，常規高壓滅菌后冷卻備用；
[0014]C、酵母菌細胞的固定化:將適量活性干酵母置于30°C無菌水中化開后，按比例與含有0.6%海藻酸鈉的6%聚乙烯醇水溶液混勻，再用注射器逐滴滴入含I %氯化鈣的5%硼酸液中，制得直徑為3_左右的固定化凝膠顆粒，固化50min，濾出固定化凝膠顆粒，用生理鹽水洗滌3次，浸入無菌水中備用；
[0015]D、固定化酵母細胞的增殖:將固定化酵母細胞凝膠顆粒用無菌水浸洗5次，加入同體積的固定化酵母活化增殖培養基，于30°C、120r/min通氣振蕩培養，13h后酵母細胞開始增殖。
[0016]當培養時間至24小時時，游離酵母數為3.8X 17個/ml以上，即完成增殖過程；
[0017]E、固定化生物催化劑酒精連續發酵:
[0018]將備好的連續發酵培養基用蠕動泵恒速輸入固定化生物反應器中，控制發酵溫度30°C，在糖化醪流加速率為15ml/h?16ml/h、停留時間為3h?4h和稀釋速率為0.15h 1?0.16h 1條件下進行酒精連續發酵；
[0019]F、確定聚乙烯醇(PVA)凝膠顆粒的穩定性。
[0020]該專利的優點是通過將酵母固定化，使得酵母在發酵甜菜生產燃料酒精時可以重復利用，且提高了發酵效率和酵母的穩定性。
[0021]美國專利US5766907A，于1998年6月16日公開了一種固定化微生物細胞的方法，其采用海藻酸鈉和聚氧乙烯山梨糖醇。
[0022]以上三個專利的存在的不足之處是發酵時間相對較長,發酵效率相對較低。
【發明內容】
[0023]本發明的就是方案是為了克服現有技術中存在的原料聚乙烯醇對身體有害，對眼睛和皮膚有刺激作用，而且聚乙烯醇可燃，具有刺激性，其粉體與空氣可形成爆炸性混合物，當達到一定濃度時，遇火星會發生爆炸，加熱分解產生易燃氣體、發酵時間相對較長，發酵效率相對較低的不足之處，而提出了一種固定化糖化酶及酵母同步糖化發酵木薯生產乙醇的方法，該方法選取海藻酸鈉和聚氧化乙烯為載體，代替聚乙烯醇在共固定化酵母菌細胞和糖化酶上的應用。本發明適用于制備固定化細胞或固定化酶，采用該法制備的固定化細胞或酶可用于化工、生物、醫學等領域，進行發酵、細胞與酶的增值、核酸提純和DNA分離坐寸ο
[0024]本發明可應用到淀粉質原料發酵生產乙醇的工業化上，固定化細胞發酵技術有許多突出優點:由于大大增加了細胞濃度，增強了菌體對外部條件溫度和酸堿度抵抗能力；縮短了發酵周期，提高反應器單位體積生物轉化速率；而且由于細胞被固定，減少了細胞流失，細胞可長時間反復使用，并為產物分離等發酵連續化和規模化提供了方便。
[0025]本發明的技術方案:
[0026]一種固定化糖化酶及酵母同步糖化發酵木薯生產乙醇的方法，該方法包括如下步驟:
[0027](I)發酵液化醪液的制備:以木薯粉、水和α -淀粉酶為原料，液化溫度為80°C?90 0C，充分攪拌并保溫60min?160min，控制DE值在16%?22%，然后添加硫酸銨0.25g/L ?0.35g/L、硫酸鎂 0.045g/L ?0.055g/L、磷酸二氫鉀 0.145g/L ?0.155g/L，制得發酵液化醪液；
[0028](2)糖化酶與酵母固定細胞的制備:將質量濃度為2%?3%海藻酸鈉和0.1%?
0.5%聚氧化乙烯混合制備成凝膠，然后將15U/g?25U/g的液體糖化酶與4g/L?5g/L超級釀酒高活性干酵母添加制備好的凝膠液中混合，混合均勻后用注射器逐滴滴加到2%?5%的氯化I丐溶液中，形成粒徑3mm?5mm的小球,在3°C?5°C下平衡反應靜置過夜后備用；
[0029](3)將步驟(2)中制備的糖化酶與酵母固定細胞添加到液化醪液中，pH控制在
4.0?5.0,發酵溫度在35°C?40°C，固定細胞的填充率在45%?55%之間，攪拌轉數150rpm/min，發酵時間40h，發酵終止時，發酵濃醪液乙醇質量濃度達到13%?15%。
[0030]所述木薯粉與水的質量比為1:3。
[0031]所述的α -淀粉酶添加量為5U/g?15U/g。