激酶的核苷酸序列，具體示于序列表中SEQ ID N0:1，相應的氨基 酸序列為序列表中的SEQ ID N0:2。
[0046] 實施例2
[0047] 肌酸激酶突變體的制備
[0048] 以質粒p R S E T - c k m (見實施例1 )為模板，設計引物對1 2 1 D F : 5 ' GCAGTTGTTGAAGTTATTAAAGAAATAAAAGGTGT 3' 和 121DR:5' TTAATAACTTCAACAACTGCTTTAGGAACCA 3,。
[0049] 用引物對ckm-F和121DR擴增F-DR片段，用引物對121DF和ckm-R擴增DF-R片段。擴 增反應條件為：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S〇4,2mM MgS〇4,0.1% Triton X-100,50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP，1.5U Pfu DNA聚合酶 (Promega，USA)，20ng pRSET-ckm，以及400nM引物ckm-F和400nM引物 121DR(或者，400nM引 物121DF和400nM引物ckm-R)，用無菌水調反應體積至50微升。
[0050] PCR擴增反應程序為:95°C3分鐘，35圈循環:95°C50秒、52°C30秒和72°C3分鐘，最 后72°C5分鐘。經1%瓊脂糖膠電泳分離并用商業試劑盒回收，分別得到F-DR片段和DF-R片 段。
[0051 ] 然后擴增全長基因，擴增反應條件為：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH4)2S〇4,2mM MgS〇4,0.1%Triton X-100,50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP， 400nM引物ckm-F和400nM ckm-R，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng F-DR片段與20ng DF-R片段， 用無菌水調反應體積至50微升。
[0052] PCR擴增反應程序為:95°C3分鐘，35圈循環:95°C50秒、52°C30秒和72°C3分鐘，最 后72°C5分鐘。經1%瓊脂糖膠電泳分離并用商業試劑盒回收，得到全長突變基因 L121D。 [0053] 將L121D片段回收并經限制性內切酶Ndel和BamHI酶切后與經同樣限制性內切酶 Ndel和BamHI酶切的載體pRSET-A連接，得質粒pRSET-L121D。將質粒pRSET-L121D轉入感受 態細菌細胞E.coli BL21，經DNA測序確定L121D的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:3所 不。
[0054] 實施例3
[0055]酶的提取與純化
[0056]將含肌酸激酶親本基因的質粒pRSET-ckm以及含肌酸激酶突變體基因的質粒 PRSET-L121D分別轉化感受態細菌細胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡 那霉素)上37°C培養24小時。接種單個克隆于5毫升LB液體培養基(含50mg/L卡那霉素）中于 30°(：培養20-24小時。離心收集菌體，并懸浮于1毫升10011111^ 8-!1(：1緩沖液(？!17.5)中。然 后用超聲波裂解細菌細胞。離心（1〇°(：，17,80(^，10分鐘)并收集上清液，即分別得肌酸激酶 親本以及肌酸激酶突變體的粗提蛋白（或稱粗提物）。
[0057] 實施例4
[0058]酶活性的測定
[0059] 配制底物溶液：含100mM的肌酸（Creatine)、5mM的ATP、20mM的MgCl2、40mM三聚磷 酸鈉和100mM Tris-HCl緩沖液，調pH至7.5。取底物溶液400微升，然后分別加入100微升的 肌酸激酶親本以及100微升的肌酸激酶突變體于37 °C進行10分鐘反應。離心（10 °C，17， 800g，15分鐘）并收集上清液，通過高壓液相色譜(HPLC)測定所得上清液中磷酸肌酸的含 量。一單位酶比活性定義為在上述條件下每分鐘轉化一微摩爾肌酸為磷酸肌酸所需之酶 量。測定結果為:肌酸激酶親本的特異性活力為3.5U/mg，肌酸激酶突變體的特異性活力為 5.3U/mg。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定酶蛋白濃度，測定結果為:肌酸激酶親本的酶比活 性為100,肌酸激酶突變體的酶比活性為152。
[0060] 實施例5
[0061 ]固定化肌酸激酶突變體的制備
[0062] 取肌酸激酶突變體粗酶，用洗酶緩沖液(0.02M Tris-HCl/0.001M EDTA，pH 7.0溶 液)稀釋至蛋白含量為5-10mg/ml。將酶稀釋液與PB溶液(2.OmoVL磷酸二氫鉀，pH 7.5)等 體積混合，加入酶固定化載體LX-3000(10毫克酶/克載體），于搖床(轉速lOOrprn)中25°C反 應20小時。反應完成后用濾袋過濾，用洗酶緩沖液清洗5-6次，得到固定化肌酸激酶突變體。
[0063] 實施例6
[0064] 用固定化肌酸激酶突變體制備磷酸肌酸
[0065] 配制底物溶液：含100mM的肌酸（Creatine)、5mM的ATP、20mM的MgCl2、40mM三聚磷 酸鈉和100mM Tris-HCl緩沖液，調pH至7.5。取底物溶液1毫升，然后加入0.05克固定化肌酸 激酶突變體。于37°C進行反應2-20小時。離心（10°(：，17,80(^，15分鐘）并收集上清液。通過 高壓液相色譜(HPLC)測定所得上清液中磷酸肌酸的含量。結果表明：肌酸轉化為磷酸肌酸 的轉化率超過85 %。
【主權項】
1. 一種生物催化生產磷酸肌酸的方法，其特征在于：以肌酸和三磷酸腺苷為底物，在肌 酸激酶突變體的催化作用下生產磷酸肌酸，所述肌酸激酶突變體具有如SEQ ID N0:3所示 的氨基酸序列。2. 根據權利要求1所述的生物催化生產磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述肌酸與所述 三磷酸腺苷的摩爾比為20:1。3. 根據權利要求1所述的生物催化生產磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述催化過程還 需加入MgCl2和三聚磷酸鈉。4. 根據權利要求1所述的生物催化生產磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述催化過程是 在pH值為7~8的緩沖溶液中進行。5. 根據權利要求4所述的生物催化生產磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述緩沖溶液為 Tris-HCl緩沖溶液。6. 根據權利要求1所述的生物催化生產磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述肌酸激酶突 變體為固定在酶固定化載體上的固定化肌酸激酶突變體。7. 根據權利要求6所述的生物催化生產磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述酶固定化載 體為環氧型LX-3000、二氧化硅、活性炭、玻璃珠或者大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯。8. 根據權利要求6所述的生物催化生產磷酸肌酸的方法，其特征在于，所述固定化肌酸 激酶突變體的加入量為〇. 01-0.5g/ml緩沖溶液。9. 根據權利要求6所述的生物催化生產磷酸肌酸的方法，其特征在于，所述固定化肌酸 激酶突變體的制備方法包括以下步驟： (1) 制備洗酶緩沖液:〇.02M Tris-HCl和0.001M EDTA的混合溶液，pH值為7.0; (2) 制備PB溶液:2 · Omol/L磷酸二氫鉀，pH值為7 · 5; (3) 用步驟（1)制備的洗酶緩沖液將所述肌酸激酶突變體稀釋至5-10mg/ml，并將得到 的酶稀釋液與步驟(2)制備的PB溶液等體積混合，再加入所述酶固定化載體，于搖床中反 應，所述酶固定化載體的加入量為10毫克酶/克載體； (4) 待步驟(3)反應完全后將所得反應液過濾，并用步驟（1)制備的洗酶緩沖液清洗，即 得固定化肌酸激酶突變體。10. 根據權利要求1至9任意一項所述的生物催化生產磷酸肌酸的方法，其特征在于，所 述肌酸激酶突變體的制備方法包括以下步驟： (1) PCR擴增具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的肌酸激酶親本，擴增引物對如下 ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '， ckm-R:5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '； (2) 步驟(1)擴增的產物經限制性內切酶酶切后與載體連接，得質粒A; (3) 以步驟(2)得到的質粒A為模板，PCR擴增得F-DR片段，擴增引物對如下 ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '， 121DR:5 ' TTAATAACTTCAACAACTGCTTTAGGAACCA 3 '； (4) 以步驟(2)得到的質粒A為模板，PCR擴增得DF-R片段，擴增引物對如下 12IDF:5 ' GCAGTTGTTGAAGTTATTAAAGAAATAAAAGGTGT 3 '， ckm-R:5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '； (5) 以步驟(3)得到的F-DR片段以及步驟(4)得到的DF-R片段為模板，PCR擴增得全長突 變體基因 L121D，擴增引物對如下 ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '， ckm-R:5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '； (6) 步驟(5)得到的L121D經限制性內切酶酶切后與載體連接，得質粒B; (7) 將步驟(6)得到的質粒B轉化感受態細菌細胞中，對轉化細菌進行增殖培養并誘導 表達，然后進行細胞破碎處理，提取即得肌酸激酶突變體。
【專利摘要】一種生物催化生產磷酸肌酸的方法，涉及磷酸肌酸的制備方法的技術領域。本發明提供的方法主要解決磷酸肌酸現有的生物催化生產方法產率低、成本高的技術問題，該方法具體為以肌酸和三磷酸腺苷為底物，在肌酸激酶突變體的催化作用下生產磷酸肌酸，所述肌酸激酶突變體具有如SEQ？ID？NO：3所示的氨基酸序列，該氨基酸序列的特點是將肌酸激酶親本的氨基酸序列中第121位點的Leu突變為Asp。該肌酸激酶突變體的比活性較肌酸激酶親本高出52%，該方法使肌酸轉化為磷酸肌酸的轉化率超過85%，適于大規模工業化生產。
【IPC分類】C12N11/14, C12N11/08, C12N9/12, C12P13/00
【公開號】CN105647985
【申請號】
【發明人】傅榮昭, 張琦
【申請人】邦泰生物工程(深圳)有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月8日