轉基因牡丹愈傷組織的gus基因組織化學染色方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物技術應用領域，涉及轉基因牡丹愈傷組織的GUS基因組織化 學染色溫度方法。
【背景技術】
[0002] GUS(i3_葡萄糖苷酸酶)基因是轉基因植物使用較多的一種報告基因，具有檢測快 速簡潔高效的特點。GUS組織化學法染色原理為：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作為反應底物，將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡。若組織細胞發生了 gus基因的 轉化，并表達出Gus，在適宜的條件(一般為37°C)下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍色產物， 這是由其初始產物經氧化二聚作用形成的靛藍染料，它使具Gus活性的部位或位點呈現藍 色，用肉眼或在顯微鏡下可看到，且在一定程度下根據染色深淺可反映出Gus活性。因此利 用該方法可觀察到外源基因在特定器官、組織，甚至單個細胞內的表達情況。
[0003] 在對轉基因牡丹愈傷組織進行GUS組織化學染色檢測時，參照Jefferson的方法， 試驗中發現牡丹愈傷組織在37°C環境下染色后，全部褐化死亡，無 GUS瞬時表達活性。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是:針對牡丹愈傷組織在進行⑶S組織化學染色時，37°C 環境下，全部褐化死亡，無 GUS瞬時表達活性。因此根據牡丹愈傷對溫度較為敏感的特性，需 要對染色溫度進行調整。
[0005] 本發明的技術方案是:一種轉基因牡丹愈傷組織的GUS基因組織化學染色方法：
[0006] 將轉基因牡丹愈傷組織從培養基中取出，用蒸餾水洗去殘留菌體，放入離心管中， 加入Buffer A至沒過愈傷組織，置于24°C環境中，侵泡lh，用移液槍將Buffer A吸出，加入 Buffer B至沒過愈傷組織，置于24°C黑暗環境中染色過夜或數小時，至愈傷組織出現藍色；
[0007] Buffer A成分如下：
[0008]
[0009] 其中0.2M NaP〇4buffer溶液由0.2M Na2HP〇4和0.2M NaH2P〇4混合配制而成，每 100ml的0.2M NaP〇4buffer溶液由62ml 0.2M Na2HP〇4和38ml 0.2M NaH2P〇4混合而成， Buffer A置于4 °C保存；
[0010] Buffer B由Buffer A和X-gluc混合配制而成，X-gluc的濃度為lmg/ml，Buffer B 置于-20°C，避光保存。
[0011]0.21恥2冊〇4配制方法：將7.168恥2冊〇4溶于水，定容至10〇1111 ;0.21恥!12?〇4的配 制方法:將3.12g NaH2P〇4溶于水，定容至100ml。
[0012] 本發明的有益效果是：試驗GUS基因組織化學染色方法參照Jefferson的方法，在 37°C環境中進行染色。但試驗表明，37°C不是牡丹愈傷染色的適宜溫度。在染色過程中發 現，牡丹愈傷組織經37°C過夜后，均褐化死亡，且無⑶S活性表達。由于牡丹愈傷組織對溫度 較為敏感，因此將染色方法做以優化改進，在24°C即愈傷正常生長的環境中進行染色，經過 染色處理，愈傷仍保持很好的活力，且可明顯看到轉化位點有靛藍色物質沉積。根據本試驗 的結果，將原⑶S基因組織化學染色方法中的37°C優化為24°C。
[0013] 將試驗篩選得到的增殖生長良好的愈傷組織進行GUS組織化學染色的檢測，試驗 結果成功檢測到⑶S活性的表達，愈傷組織碎塊呈藍色，表明新生的愈傷組織中存在⑶S活 性位點，初步表明通過該遺傳轉化體系，成功將GUS基因轉入牡丹愈傷組織中，且GUS活性能 夠穩定良好表達。
【具體實施方式】
[0014] -種轉基因牡丹愈傷組織的GUS基因組織化學染色方法：
[0015] 將轉基因牡丹愈傷組織從培養基中取出，用蒸餾水洗去殘留菌體，放入離心管中， 加入Buffer A至沒過愈傷組織，置于24°C環境中，侵泡lh，用移液槍將Buffer A吸出，加入 Buffer B至沒過愈傷組織，置于24°C黑暗環境中染色過夜或數小時，至愈傷組織出現藍色；
[0016] Buffer A成分如下：
[0017]
[0018] 其中0.2M NaP(kbuffer溶液由0.2M Na2HP〇4和0.2M NaH2P〇4混合配制而成，每 100ml的0.2M NaP〇4buffer溶液由62ml 0.2M Na2HP〇4和38ml 0.2M NaH2P〇4混合而成， Buffer A置于4 °C保存；
[0019] Buffer B由Buffer A和X-gluc混合配制而成，X-gluc的濃度為lmg/ml，Buffer B 置于-20°C，避光保存。
[0020] 0.21恥2冊〇4配制方法：將7.168恥2冊〇4溶于水，定容至10〇1111 ;0.21恥!12?〇4的配 制方法:將3.12g NaH2P〇4溶于水，定容至100ml。
【主權項】
1. 一種轉基因牡丹愈傷組織的GUS基因組織化學染色方法，其特征在于： 將轉基因牡丹愈傷組織從培養基中取出，用蒸饋水洗去殘留菌體，放入離屯、管中，加入 Buffer A至沒過愈傷組織，置于24°C環境中，侵泡化，用移液槍將Buffer A吸出，加入 Buffer B至沒過愈傷組織，置于24°C黑暗環境中染色過夜或數小時，至愈傷組織出現藍色； Buffer A成分如下：其中0.2M化PCkbuffer溶液由0.2M化抽P化和0.2M化此P〇4混合配制而成，每100mL的 0.2M NaPCkbuffer溶液由62ml 0.2M Na2HP〇4和38ml 0.2M N址2P〇4混合而成，Buffer A置于 4°C保存； Buffer B由Buffer A和X-gluc混合配制而成，X-gluc的濃度為lmg/ml，Buffer B置于-20°C，避光保存。2. 根據權利要求1所述的轉基因牡丹愈傷組織的GUS基因組織化學染色方法，其特征在 于：0.2M化抽Kk配制方法：將7.16g化抽Kk溶于水，定容至100ml;0.2M化出P〇4的配制方 法:將3.12g Na出P〇4溶于水，定容至100mL。
【專利摘要】本發明公開一種轉基因牡丹愈傷組織的GUS基因組織化學染色方法，將轉基因牡丹愈傷組織從培養基中取出，用蒸餾水洗去殘留菌體，放入離心管中，加入Buffer？A至沒過愈傷組織，置于24℃環境中，侵泡1？h，用移液槍將Buffer？A吸出，加入Buffer？B至沒過愈傷組織，置于24℃黑暗環境中染色過夜或數小時，至愈傷組織出現藍色。本發明將原GUS基因組織化學染色方法中的37℃優化為24℃。將試驗篩選得到的增殖生長良好的愈傷組織進行GUS組織化學染色的檢測，試驗結果成功檢測到GUS活性的表達，愈傷組織碎塊呈藍色，表明新生的愈傷組織中存在GUS活性位點。
【IPC分類】C12Q1/34
【公開號】CN105648032
【申請號】
【發明人】何松林, 王政, 賀丹, 申萍, 李永華, 李曉娟
【申請人】河南農業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月4日