一種測定運動小鼠胰腺組織樣品中胰蛋白酶的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于電化學技術領域，以肽為識別單元和亞甲基藍為信號分子對胰蛋白酶 含量進行檢測。具體涉及一種測定運動小鼠胰腺組織樣品中胰蛋白酶的方法。
【背景技術】
[0002] 胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白水解酶。在脊椎動物中，它不僅起消化酶的作用，而且 還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。胰蛋白酶是 特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。
[0003] 目前發展起來的測定胰蛋白酶的方法主要有紫外分光光度法(Zhang L，Du J.A sensitive and label-free trypsin colorimetric sensor with cytochrome c as a substrate [J] · Biosensors&Bioelectronics，2016，79: 347-352 ·)、液態晶體法（Chuang C H, Lin Y C, Chen ff L，et al. Detecting trypsin at liquid crystal/aqueous interface by using surface-immobilized bovine serum albumin.[J].Biosensors& Bioelectronics，2015,78.)、焚光法(穆麗璇，師文生.胰蛋白酶焚光化學傳感器的制備方 法：，CN104152141A[P].2014;賈蘭，陳松，劉祥，侯文娟，張耀東.一種用于胰蛋白酶檢測的 熒光探針及其制備方法：，CN104946249A[P].2015)、電化學方法(Ru-Ping L，Xia〇-Cui T， Ping Q，et al.Multiplexed Electrochemical Detection of Trypsin and Chymotrypsin Based on Distinguishable Signal Nanoprobes[J].Analytical Chemistry,2014,86(18):9256~9263；Qiang Yi,Qicai Liu,Feng Gao,Qingquan Chen, Guina Wang.Application of an Electrochemical Immunosensor with a MffCNT/PDAA Modified Electrode for Detection of Serum Trypsin[J]. Sensors,2014,14(6): 10203-10212·)、石英晶體微天平法（Stoytcheva M，Zlatev R，Cosnier S，et al.High sensitive trypsin activity evaluation applying a nanostructured QCM-sensor [J]·Biosensors&Bioelectronics，2012,41(1):862_866;Bayramoglu G，Arica M Y.Development of a sensitive method for selection of affinity ligand for trypsin using quartz crystal microbalance sensor.[J].Bioprocess&Biosystems Engineering，2012,35(3):423-431·)、目視比色法（ZaccheoBA，CrooksRM·Self-Powered Sensor for Naked-Eye Detection ofSerum Trypsin[J].Analytical Chemistry，2011,83(4):1185-8.)等。但是，這些方法各有其缺點。
[0004] 本發明利用利用戊二醛法，通過肽末端氨基與DNA氨基作用，將肽和DNA交聯，得 肽/DNA;然后利用Au原子與肽末端巰基之間作用，將肽/DNA修飾在金電極表面;再加入H1和 H2,發生雜交鏈式反應形成DNA雙鏈，然后加入亞甲基藍，亞甲基藍扦插在形成的DNA雙鏈 中；當有目標物胰蛋白酶存在時，胰蛋白酶將肽切割導致扦插有亞甲基藍的DNA雙鏈從電極 上脫落，電化學信號降低，根據電化學信號的強弱實現目標物胰蛋白酶的測定，建立了一種 對運動小鼠胰腺組織樣品中胰蛋白酶高靈敏度特異性檢測的電化學方法，方法具有簡單， 成本低，靈敏度高的特點。
【發明內容】
[0005] 本發明提供一種特異性檢測運動小鼠胰腺組織樣品中胰蛋白酶含量的方法，利用 戊二醛法，通過肽末端氨基與DNA氨基作用，將肽和DNA交聯，得肽/DNA;然后利用Au原子與 肽末端巰基之間作用，將肽/DNA修飾在金電極表面;再加入H1和H2,首先發生雜交鏈式反應 形成DNA雙鏈，然后加入亞甲基藍，亞甲基藍扦插在形成的DNA雙鏈中；當有目標物胰蛋白酶 存在時，胰蛋白酶將肽切割導致扦插有亞甲基藍的DNA雙鏈從電極上脫落，電化學信號降 低，根據電化學信號的強弱實現目標物胰蛋白酶的測定。
[0006] 技術方案
[0007] 一種測定運動小鼠胰腺組織樣品中胰蛋白酶的電化學方法，以亞甲基藍作為信號 分子，利用以胰蛋白酶對肽的特異性切割作用，以電化學方法檢測法測定胰蛋白酶的含量。 測定步驟如下：
[0008] (1)肽/DNA1 的制備
[0009]取0.1~20yg肽固體分散在含5%戊二醛的ros緩沖溶液中，持續攪拌2h后再向溶 液中加入1 OOyL濃度為0.1~1 OOOmM的DNA1溶液，4 °C振動孵育12h后，得肽修飾DNA 1，即肽/ DNA1，4°C下保存。
[0010] (2)肽/DNA修飾金電極制備
[0011] 首先將金電極分別用1 · Ομπι，0 · 3μπι，0 · 05μπι氧化鋁粉拋光，依次用蒸餾水，乙醇和 蒸餾水分別超聲5min，最后在0.1Μ的H2SO4溶液中進行循環伏安掃描直至電流電壓曲線穩 定;在潔凈的金電極表面滴加（1)所得的1~60yL肽/DNA溶液，在25 °C下組裝120min。修飾了 肽/DNA的金電極表面用去離子水洗凈三次，用高純氮氣吹干。然后將金電極浸入ImM的巰基 己醇溶液中，25°C下封閉60min，充分洗凈后得肽/DNA修飾金電極，4°C下保存備用。
[0012 ] (3) HI、H2和MB自組裝肽/DNA修飾金電極
[0013] 取1~60yL含0.001~400μΜ的H1和H2的混合溶液滴于（3)所得的肽/DNA修飾金電 極表面。在室溫下反應一段時間后，再用50yL的PBST溶液洗滌三遍。然后再取1~60yL含 0.001~400mM的MB溶液滴于電極表面，在室溫下反應30分鐘后，再用50yL的TOST溶液洗滌 三遍。得HI、H2和MB自組裝肽/DNA修飾金電極。
[0014] (4)電化學方法測定胰蛋白酶
[0015] 將1~60yL胰蛋白酶樣品溶液滴加到HI、H2和MB自組裝肽/DNA修飾金電極表面，在 室溫下反應30min。然后，用磷酸緩沖溶液反復沖洗電極表面三次。以上述所得電極為工作 電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為輔助電極，利用差分脈沖伏安法(DPV)在磷酸緩 沖溶液中以1~l〇〇〇mV/ s的掃速進行掃描，電位掃描范圍為-0.4到-0.1 V。根據電化學信號 對胰蛋白酶進行定量。
[0016] (5)運動小鼠胰腺組織樣品測定
[0017]小鼠運動方式采用一次性力竭性游泳，水溫控制在32土 1°C，小鼠游泳池規格為長 100cm X 50cm X 50cm，小鼠持續下沉十秒不能露出水面為力竭標準。小鼠斷頭取材，按1:10 加入勻漿介質后，將其制成組織勻漿，在3000轉/分鐘的條件下冷凍離心15min，取上清液按 (4)所述方法測定胰蛋白酶。
[0018]本發明實驗用水為二次蒸餾水。
[0019]本發明所使用的磷酸緩沖溶液配制方法為：在一升水中溶解〇.2g KH2P〇4和2.9g Na2HP〇4獲得0.1M pH 7.4的磷酸緩沖液。
[0020] 本發明所使用的PBS配制方法為:將0.2g KH2P〇4、8.0g NaCl和0.2g KC1溶解于一 升水中，得到0.15M pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液，即PBS。
[0021] 本發明所使用的rosi1配制方法為：將磷酸緩沖溶液中加入Tween-20,使Tween-20 的體積比為0.05%，即得PBST溶液。
[0022] 本發明的電化學工作站選用CHI660D型電化學工作站(上海辰華儀器有限公司）。 [0023]本發明的顯著效果
[0024] 本發明研究了不同濃度的胰蛋白酶與電化學信號之間的關系，得到了檢測胰蛋白 酶的標準曲線，線性范圍及線性方程。當胰蛋白酶的濃度在2.0ng ml^-TOOng ml/1之間時， 隨著胰蛋白酶濃度的變化，DPV強度有明顯變化。經計算得到檢測胰蛋白酶的線性方程為I =0.47085C-1.25723(Ipa為DPV峰電流強度，單位nA;C為胰蛋白酶的濃度，單位ng mL-1;R2 = 0.9997