MgC12 ;dNTPs混合物，該dNTPs混合物為三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸dGTP，三磷 酸腺嘌呤脫氧核苷酸dATP，三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸dTTP，三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸 dCTP四種核苷酸，各組分濃度為2. 5mM ;5υ/μ 1熱啟動Taq酶。
[0013] (3)瓊脂糖凝膠電泳分析試劑：瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標準、Goldview 染色液和DNA上樣緩沖液，該緩沖液以溴酚藍為指示劑稀釋至IX后使用。
[0014] 使用上述耐力水平基因檢測試劑盒按如下步驟進行檢測： (1)提取樣本基因組DNA。
[0015] 采集該測試者唾液，向l_2ml唾液樣品中加入500ul提取緩沖溶液，該DNA提取 緩沖溶液溶劑為50mM的Tris-HCl pH7. 4、0. 5mM的EDTA和50mM的NaCl，反復吹打混勻 后，8000Xg離心5分鐘，棄去上清，此步驟重復一次；得到的沉淀中加入500ul裂解液， 該裂解液溶劑為 50mM Tris-HCl pH7.4,50mM Tris-HCl ρΗ7· 4,150mM NaCl，lmM EDTA，1% Triton x_100，l% Sodium deoxycholate，0.1% SDS，蛋白酶 K20mg/mL，徹底懸浮沉淀并 充分混勻后，室溫放置30分鐘，期間來回顛倒離心管數次；得到的混合液中，加入濃度為 lOmg/mLRNA酶的水溶液10 μ L，37°C下靜置10min ;得到的上清液中，加入等體積苯酚-氯 仿混合溶液，苯酚和氯仿體積比為1 : 1，充分混勻，混合液4°C，12000Xg離心5分鐘，上清 液移入干凈離心管內；加入等體積苯氛-氯仿-異戊醇混合溶液，苯酚、氯仿和異戊醇體積 比為25 : 24 : 1，充分混勻后，4°C，12000Xg離心5分鐘，上清液移入干凈離心管內；加 入等體積氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，4°C，12000Xg離心5分鐘，上清液移入干 凈離心管內；加入0. 6倍體積的冰浴異丙醇溶液及0. 1倍的3mol/L醋酸鈉溶液，-20°C靜 置60分鐘后，4°C，12000 X g離心10分鐘，棄上清液；得到的沉淀物中加入0. 5mL 70 %乙醇 清洗沉淀物，4°C，12000 X g離心5分鐘，棄上清液，此步驟重復一次；得到的沉淀物自然風 干，加入20 μ L無菌超純水回溶，電泳檢測，-20°C保存。
[0016] (2)PCR 擴增 本實施例同時檢測 rsl042713、rsl815739、rsl2722、rs7181866、rs8192678、 rs4253778、rsl205和rs2010963。每個SNP的檢測需要一對上下游引物、兩條多態引物共 4條PCR引物，共需要32條引物。每個SNP的檢測需要做兩管PCR擴增，為防止出現假陽性 之類的反應，衡量PCR是否成功，加設一管陰性對照組，共做17管PCR，所述陰性對照組基 因組模板及反應體系是一樣的，但沒有引物存在。
[0017] 根據不同的檢測位點，用相應的引物按如下比例分別配制PCR反應體系： 2·5μ 110XPCR緩沖液，2μ 1 dNTPs，0.5y 1引物組，熱啟動Taq酶0· 15μ 1，基因組模板 80mg，添加超純水至總體積為25 μ 1。
[0018] 將裝有反應溶液的Eppendorf試管放入ΑΒΙ 9700 PCR儀中，設置反應條件如下： 預變性95°0 31^11;熱循環941：3〇8,6〇1：3〇8,721：3〇8,35個循環；延伸721：31^11。反應 結束后，取出試管。
[0019] 由于17管PCR擴增反應是在同一臺PCR儀上同步進行的，為了實現檢測的高 效性、特異性，要求32條PCR引物的Tm值相近，為此需要先進行大量的DNA序列軟件分析 來設計PCR引物，并通過大量的實驗來進行Tm值的優化并確定設計的合理性，本試劑盒各 基因 SNP多態性的檢測是既相對獨立又相互聯系的，不可分割。
[0020] (3 )瓊脂糖凝膠電泳檢測 將擴增后的產物進行瓊脂糖電泳檢測，過程如下：3g瓊脂糖，加入100mL去離子水，微 波爐加熱lmin，冷卻到60°C時加入5 μ L Goldview染色液，制成3%的瓊脂糖凝膠。PCR產 物10 μ L與6 X TBE緩沖液0. 8 μ L混合上樣，電壓100V電泳15min。紫外燈下讀取結果并 拍照，所得瓊脂糖電泳檢測圖如圖1所示。
[0021] 檢測得到8個基因分型分析結果如下：
根據以上分型結果，該測試者的耐力水平較高，適合耐力類的運動項目。如果是專業運 動員，其耐力水平雖然較高，但尚沒有達到頂尖水平，建議國家級運動機構不重點培養。如 果是業余健身愛好者，則在其日常的鍛煉中，多注意提高耐力相關運動，可適當增加強度， 比如增加每日跑步的時間和距離，而不是速度。耐力運動可大大提高該測試者的心肺功能， 有益健康。
[0022] 以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和 原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.耐力水平基因檢測試劑盒，包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，其特征在于：存放 的試劑包括： (1)針對8個基因 SNP多態位點的PCR反應引物組（以下引物序列方向均為5'端至3' 立而）： 針對SNP rsl042713的引物組： 1 CCTTCTTGCTGGCACCCAATA 2 GTCCGGCGCATGGCTTCC 3 GCTGAGTGTGCAGGAC 4 CCAGTGAAGTGATGAAG 針對SNP rsl815739的引物組： 1 CTGCCCGAGGCTGACC 2 GGCACCTCGCTCTCA 3 GCACACTGCTGCCCTTTC 4 CACATCTGAAGATGGAC 針對SNP rsl2722的引物組： 1 CTCTGTCCACACCCAC 2 CTCCCGGGGCGCA 3 TCTACGCCTCGGCAC 4 AATGGATCGTGTTGGAG 針對SNP rs7181866的引物組： 1 CATAGAATAGGAGAGAGTA 2 CACCATCATTTTGGGC 3 CCTAATGGAGTTTTTTTC 4 GTGATTAACGCATCCC 針對SNP rs8192678的引物組： 1 GAAGCAGACAAGACCA 2 CTGTCCCTCAGTTCACC 3 GAGAGACTTTGGAGGCA 4 AGGAGACACATTGAAC 針對SNP rs4253778的引物組： 1 CTTGATATCTAGTTTC 2 GAAATGAAGCTTTTGAATCC 3 TCCCCACTCTGGGTCTCCT 4 TATTCATAGACTAGG 針對SNP rsl205的引物組： 1 GTTTGGCTTCTGTCCTCAC 2 CACATGGAGAGAGACTA 3 TAGTCACAACTTCTAAAG 4 GAGGATAGTTGGATAG 針對SNP rs2010963的引物組： 1 GTGCGAGCAGCGAAAGC 2 GCACTTTGCCCCTGTCC 3 AGCGGACTCACCGGCCAG 4 GGGCTCACGCCGCGCTC (2) PCR擴增試劑； (3) 瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。2. 根據權利要求1所述的耐力水平基因檢測試劑盒，其特征在于：所述引物用量均為 0· 5_1· Ο μ 1 〇3. 根據權利要求1所述的耐力水平基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴增試劑 包括：10XPCR緩沖液，dNTPs，熱啟動Taq酶，基因組模板。4. 根據權利要求3所述的耐力水平基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR緩沖液包 含：100mM Tris-HCl pH8.3,500mM KCl，15mM MgCl2。5. 根據權利要求3所述的耐力水平基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴增試 劑用量為：l〇XPCR緩沖液2. 5μ 1，dNTPs2l·! 1，熱啟動Taq酶0. 1-0. 2μ 1，基因組模板 50-100ng〇6. 根據權利要求1所述的耐力水平基因檢測試劑盒，其特征在于：所述瓊脂糖凝膠電 泳分析試劑包括：瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標準、DNA無毒染料和DNA上樣緩沖 液。7. 根據權利要求6所述的耐力水平基因檢測試劑盒，其特征在于：所述DNA無毒染料 優選Biotium Gelred無毒染料。
【專利摘要】本發明提供了人體耐力水平的基因檢測試劑盒，該試劑盒包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，試劑包括：（1）針對8個基因SNP多態位點的PCR反應引物組（2）PCR擴增試劑（3）瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。本發明通過PCR引物的設計使多個PCR擴增反應可在同一臺PCR儀上同步進行，對受測者的相關基因進行檢測，并實現檢測的高效性、特異性，分析得到耐力力水平的基因基礎，評估個體是否適合從事與耐力力相關的體育項目，為專業體育機構和教練提供選拔運動員的科學依據。對于大眾健身鍛煉來講，為個體提供個人潛在的運動能力評估，幫助個體更好的選擇適合自身體質條件的運動項目，從而更有效合理的發揮自身優勢，達到鍛煉目的。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105648048
【申請號】
【發明人】李則軒, 張舒, 朱軼凡, 邱嘉銘, 張靜靜, 別茜, 范家成, 盧駿
【申請人】武漢白原科技有限公司, 湖北省體育科學研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年11月17日