和P2引物擴增霍亂弧菌01和0139群基因組DNA，將PCR產物克隆至PMD-18T 載體，轉化DH5a大腸桿菌，利用堿裂解法提取陽性克隆質粒，利用紫外可見分光光度計分別 測定在波長260nm處、280nm處DNA的吸光率，然后計算質粒濃度與純度。然后10倍梯度稀釋 至2000拷貝每微升，制備霍亂弧菌的陽性標準品。
[0024]反應條件優化 對引物、探針、酶等要素逐一優化，確定的反應體系為：2XPCR緩沖液10 μ1、10_〇1/1 dNTP 1.0yl、25ymol/L引物各0.5 yl、10ymol/L 探針0.2 yl、Takara聚合酶混合物0.4 μL、 模板2ul，加滅菌水至終體系20 μL。
[0025] 根據擴增片段長短、引物和探針的退火溫度以及酶的特性，主要對反應退火溫度 和延伸時間進行了優化，最終確定的循環參數為:94°C，2min;進入循環階段:94°C變性10s， 56°C退火50s，72°C延伸15s，40個循環，每個循環在退火階段采集熒光信號。
[0026] 在擴增結束后按同一條件分析數據，確定各樣品的Ct值。
[0027]檢測限的評價 以上述5中的陽性標準品評價本發明的提供的試劑盒的檢測限，陽性標準品濃度為:2 X lC^copies/yl、2 XlC^copies/yl、2 X105copies/yl、2 XlC^copies/yl、2 X103copies/yl， 本發明提供的試劑盒對霍亂弧菌01和0139群核酸的檢測下限均為100拷貝每反應體系。 [0028]檢測特異性的評價 以上述菌株DNA為模板評價了本試劑盒的特異性。對霍亂弧菌01和0139群基因組DNA進 行檢測時均可見明確擴增曲線，對上述9種其他咽部常見病原微生物DNA檢測時，未產生陽 性擴增曲線，說明我們使用的探針和引物與我們選定的其他菌株之間不存在交叉反應。
[0029] 盡管上文中以優選的方式，通過具體實施例示例性說明了本發明的某些實施方 式，但是本領域技術人員應了解，本發明并不限于上面所公開的實施方式，而是可以根據本 發明所屬技術領域的知識對其進行修改，所作修改不會超出本發明要求保護的范圍。例如， 本發明所使用的熒光實時PCR也可以根據需要采用說明書中所列出的實施例中指出的熒光 報告基團和熒光淬滅基團以外的標記物質，如 物;或使用Taqman技術之外的其他標記體系，例如MGB探針、分子信標MB探針、蝎形探針、熒 光雙雜交探針等熒光探針標記技術;或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不飽和染料與LC Green等飽和染料，只要其使用了本發明所述的特異性引物序列，即可定性或定量檢測目的 基因的存在，進而特異性地檢測霍亂弧菌的存在。所以，這些本領域技術人員所了解的改變 和慣用手段的替換也落入本發明的保護范圍內。本發明的保護范圍應由所附的權利要求書 所限定。
[0030] 序列表 〈110>江蘇和創生物科技有限公司 丁，小靜 〈120>霍亂弧菌熒光PCR檢測試劑盒 <130> <160> 6 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA 〈213>人工序列 <220> <221> primer_bind <222> (1)..(24) 〈223>根據基因組保守區設計的引物序列，用于核酸擴增和檢測 <400> 1 atattgatcc gacaagccca aatg 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA 〈213>人工序列 <220> <221> primer_bind <222> (1)..(22) 〈223>根據基因組保守區設計的引物序列，用于核酸擴增和檢測 〈400> 2 cgatgttgag gcgaagttta gg 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA 〈213>人工序列 <220> <221> primer_bind <222> (1)..(24) 〈223>根據基因組保守區設計的引物序列，用于核酸擴增和檢測 〈400> 3 tgatgttgtg ggataagcaa tctt 24 <210> 4 <211> 20 〈212> DNA 〈213>人工序列 <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) 〈223>根據基因組保守區設計的引物序列，用于核酸擴增和檢測 〈400> 4 ctcagcaatg cggtggtcta 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA 〈213>人工序列 <220> <221> misc_binding <222> (1)..(23) 〈223>根據基因組保守區設計的引物序列，用于核酸擴增和檢測 〈400> 5 cgccgcaata cgagccccaa ggt 23 <210> 6 <211> 26 <212> DNA 〈213>人工序列 <220> <221> misc_binding <222> (1)..(26) 〈223>根據基因組保守區設計的引物序列，用于核酸擴增和檢測 〈400> 6 aacccgccct tctaatgaac acgcca 26
【主權項】
1. 一種用于特異性檢測樣品中霍亂弧菌核酸的試劑盒，同時用于定性區分01和0139 群，其中包括PCR反應液、酶混合液、陰性質控品和陽性質控品；PCR反應液中用于核酸擴增 反應的引物序列如下： P1-1：5 - ata ttg ate ega caa gee caa atg _3 ， Pl-2：5 - ega tgt tga ggc gaa gtt tag g -3 ， P2~l：5 - tga tgt tgt ggg ata age aat ett _3 ， P2~2：5 - etc age aat geg gtg gtc ta _3 ， PCR反應液中用于熒光信號監測的寡核苷酸探針的序列如下： Probel: 5 -Xi_ ege ege aat aeg age ccc aag gt _Yi _3， Probe2 ： 5 -X2- aa ccc gee ett eta atg aac aeg cca -Y2 ~3， Probel熒光報告基團X^FAM，焚光淬滅基團Y^Eclipse， Probe2熒光報告基團X2為CY5，熒光淬滅基團Y2為BHQ。2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于PCR反應體系為20 μL，包括2 XPCR緩沖液 10 yl、10mmol/L dNTP 1.0 yl、25ymol/L引物各0.5 yl、10ymol/L 探針0.2 μL、熱啟動Taq 酶混合液0.4 μL、樣品DNA 2μ1，加滅菌水至終體系20 μL。
【專利摘要】本發明涉及一種采用實時熒光PCR方法特異性檢測樣品中霍亂弧菌01型和0139型核酸存在的寡核苷酸序列組合，以及包括該組合的試劑盒。利用本發明的試劑盒，可快速檢測樣品中是否存在霍亂弧菌01和0139型核酸。該試劑盒對霍亂弧菌核酸的檢測限為10拷貝每反應體系，整個反應可在3-4小時內完成，在疾病監測、臨床診斷等領域具有重要的應用價值。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/04, C12R1/63
【公開號】CN105648054
【申請號】
【發明人】不公告發明人
【申請人】江蘇和創生物科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月13日