r>[0023] PCR模板制備:腸炎沙門氏菌ATCC13076、雞傷寒沙門氏菌ATCC9184和鼠傷寒沙門 氏菌ATCC14028分別在TSB肉湯培養基中培養12h，使用商品化的細菌基因組DNA抽提試劑盒 提取上述沙門氏菌標準菌株基因組，作為待檢模板。
[0024] 多重PCR檢測試劑的配制：腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌的引 物對用滅菌雙蒸水分別稀釋為10 μΜ濃度，等體積混合后得到檢測引物組； 多重PCR擴增試劑包括：10XPCR緩沖液(其組分包括100mM KCl、80mM (NH4)S04、pH為 9.0的 100mM Tris-HCl、15mM MgC12和0.5% Tergitol-type NP-40)、dNTPs(包含dGTP、 (10?、(^了？、(11113，各組分濃度均為2.511^)、了 &9〇嫩聚合酶(2.5 1]/^1)、檢測引物組。
[0025] 多重PCR檢測體系及擴增程序:檢測體系為25μ1，具體包括：10 X PCR緩沖液2.5μ l，dNTPs 2yl，Taq DNA聚合酶0.25μ1，檢測引物組3yl、DNA模板2μ1以及適量的滅菌雙蒸 水。擴增程序的步驟包括:94°C預變性5min，94°C變性3〇8,56°(：退火3〇8、72°(：延伸3〇8，共30 個循環，最后72 °C延伸8min;反應結束，取出擴增產物4°C保存。
[0026] 多重PCR方法檢測結果的判定:取5μ1擴增產物，加 ΙμL 6 X Loading buffer混勻， 點樣于2%瓊脂糖凝膠電泳板孔中，100V電壓，電泳40min，于凝膠成像儀下拍照判定。
[0027] 結果判定標準如圖1所示，圖1中，Μ為DL-500 marker(依次為500bp、400bp、300bp、 200bp、150bp、100bp和50bp)，泳道1-3分別為鼠傷寒沙門氏菌（372bp)、腸炎沙門氏菌 (153bp)和雞傷寒沙門氏菌(276bp)，泳道4為陰性對照。
[0028]實施例2特異性評價實驗 用實施例1的方法進行本發明多重PCR檢測方法的特異性評價，將試驗菌株進行富集培 養后，煮沸法提取基因組DNA，按照實施例1所述方法進行多重PCR檢測，結果如圖2所示，只 有鼠傷寒沙門氏菌(泳道21、30 )、腸炎沙門氏菌(泳道28、39 )和雞傷寒沙門氏菌(泳道6、12、 19、36)三種血清型菌株顯示出特異性擴增條帶，其它血清型沙門氏菌以及非沙門氏菌菌株 均無非特異性擴增。所用菌株及菌株編號如下表所示，表中，檢測結果欄目中"+"表示陽 性；"一"表示陰性。
[0029]
實施例3靈敏度評價實驗 用實施例1的方法進行本發明多重PCR檢測方法的敏感性評價。將腸炎沙門氏菌 ATCC13076、雞傷寒沙門氏菌ATCC9184和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028分別在TSB肉湯培養基 中培養12h，使用商品化的細菌基因組DNA抽提試劑盒提取細菌基因組，測定其原始濃度后 10倍梯度稀釋。將不同稀釋梯度細菌基因組DNA進行靈敏度評價試驗。反應結束后取5μ1擴 增產物，加 ΙμL 6XLoading buffer混勻，使用2%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結果如圖3 所示，Μ為DL-500 marker(依次為500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp和50bp)，泳道 1-5為鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028(反應濃度依次為8724pg/反應、872 · 4 pg/反應、87 · 24 pg/ 反應、8.724 pg/反應、0.8724 pg/反應），泳道6-10為雞傷寒沙門氏菌ATCC9184(反應濃度 依次為4363pg/反應、436.3 pg/反應、43.63 pg/反應、4.363 pg/反應、0.4363pg/反應），泳 道11_15為腸炎沙門氏菌六了〇：13076(反應濃度依次為6413?8/反應、641.3?8/反應、64.13 pg/反應、6.413 pg/反應、0.6413pg/反應）。如圖3所示，上述三個血清型沙門氏菌的基因組 原液經稀釋1000倍后均可以看到較清晰的條帶，而稀釋10000倍后則看不到擴增條帶。因 此，本發明的多重PCR檢測方法最低檢出限分別為鼠傷寒沙門氏菌8.724 pg/反應，雞傷寒 沙門氏菌4.363 pg/反應，腸炎沙門氏菌6.413 pg/反應，具有較高的檢測靈敏度。檢測反應 體系如下表所示。
[0030]
實施例4多重PCR檢測試劑盒的組裝 使用細菌基因組DNA抽提試劑盒提取沙門氏菌標準株基因組DNA(腸炎沙門氏菌 ATCC13076、雞傷寒沙門氏菌ATCC9184和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028)，得到本發明的陽性對 照;根據實施例1表中的序列合成3對特異性檢測引物，用滅菌雙蒸水稀釋為10 μΜ濃度，等 體積混合后得到檢測引物組；多重PCR擴增試劑：10 X PCR緩沖液(其組分包括100mM KC1、 80mM (NH4)S04、pH為9.0的100mM Tris-HCl、15mM MgCl2和0.5% Tergitol-type NP-40)、 dNTPs(包含(16了？、(101\(^了？、(1打？，各組分濃度均為2.51111)、了39〇嫩聚合酶（2.5 1]/^1)、 檢測引物組、陽性對照(沙門氏菌標準菌株DNA模板)以及陰性對照(滅菌雙蒸水）。
[0031] 將以上所涉試劑和產品共同包裝，再配以產品使用說明書(包括產品保存條件、反 應程序和結果判定方法等），組裝成本發明所述的禽源沙門氏菌多重PCR檢測試劑盒。
[0032]實施例5臨床樣品檢測 從農貿市場采集雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉等家禽泄殖腔拭子以及市售的各種禽肉或禽蛋 制品。將上述禽源樣品接種于亞硒酸鹽胱氨酸增菌液中，37°C培養24h，使用商品化試劑盒 提取菌液基因組DNA，按照實施例1中的方法進行多重PCR檢測，同時設置陽性對照和陰性對 照。同時按照沙門氏菌檢驗國家標準(GB4789.4-2010)中的方法進行沙門氏菌分離鑒定。結 果見下表所不，表中，"SE"代表腸炎沙門氏菌，"SG"代表雞傷寒沙門氏菌，"ST"代表鼠傷寒 沙門氏菌。由表可見在采集的445份禽源樣品中，本發明方法檢出54例陽性，而國標檢測方 法共檢出33例陽性，且采用國標方法檢出的陽性樣品在本發明的多重PCR方法中均為陽性。 上述結果表明本發明試劑盒所建立的檢測方法在臨床實際檢測中的靈敏度高于傳統細菌 學檢測方法。此外沙門氏菌國標檢測方法(GB 4789.4 - 2010)所需時間為5-6天，采用本發 明試劑盒檢測全程所用時間約為4小時。
[0033]以上示意性的對本發明及其實施方式進行了描述，該描述沒有限制性，附圖中所 示的也只是本發明的實施方式之一，實際的結構并不局限于此。所以，如果本領域的普通技 術人員受其啟示，在不脫離本發明創造宗旨的情況下，不經創造性的設計出與該技術方案 相似的結構方式及實施例，均應屬于本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 禽源沙門氏菌多重PCR檢測試劑盒，其特征在于:包括多重PCR檢測引物組、陽性對照 和陰性對照，所述陽性對照包括腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和/或鼠傷寒沙門氏菌基因 組DNA;所述陰性對照為滅菌雙蒸水。2. 根據權利要求1所述的禽源沙門氏菌多重PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述陽性對 照為腸炎沙門氏菌ATCC13076、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、雞傷寒沙門氏菌ATCC9184基因 組 DNA。3. 根據權利要求1所述的禽源沙門氏菌多重PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述多重PCR 檢測體系的組分為:每25μ1反應液中包括10XPCR緩沖液2.5yl、dNTPs 2yl、Taq DNA聚合 酶0.25μ1、檢測引物組3yl、DNA模板1~2μ1以及適量的滅菌雙蒸水。4. 根據權利要求1所述的禽源沙門氏菌多重PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述多重PCR 檢測引物組包括SED ID NO 2、3、5、6、8和9所示的引物。5. 根據權利要求1所述的禽源沙門氏菌多重PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述腸炎沙 門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌的引物對濃度均為1〇μΜ，等體積混合后得到檢測 引物組。6. 根據權利要求1所述的禽源沙門氏菌多重PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述dNTPs包 括 dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各組分濃度均為2.5mM。7. -種使用禽源沙門氏菌多重PCR檢測試劑盒進行非診斷性檢測的方法，包括以下步 驟： S1:使用煮沸法或商品化試劑盒提取細菌基因組DNA，得到檢測模板。 8. S2:多重PCR擴增，將10 X PCR緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、檢測引物組以及DNA模 板加入無菌PCR反應管中，添加滅菌雙蒸水至總體積25μ1，同時設置陽性、陰性對照，使用 PCR儀進行擴增反應;采用2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行電泳檢測并分析結果。
【專利摘要】本發明公開了一種禽源沙門氏菌多重PCR檢測試劑盒及其非診斷性檢測方法。所述試劑盒包括10×PCR緩沖液、2.5？U/μl<i>？Taq？</i>DNA聚合酶、10Mm？dNTPs、多重PCR檢測引物組、陽性對照和陰性對照，所述陽性對照物包括腸炎沙門氏菌ATCC13076、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、雞傷寒沙門氏菌ATCC9184基因組DNA；所述陰性對照為滅菌雙蒸水。本發明還公開了一種應用所述試劑盒檢測禽源沙門氏菌的多重PCR方法。本發明方法具有快速、簡單、特異性強、靈敏度高的優點，通過一次PCR反應，即可對三種沙門氏菌進行快速檢測與分型，相比傳統的血清學分型與普通PCR檢測，在檢測時間與檢測成本方面具有較大優勢，適合于批量檢測。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11, C12R1/42, C12Q1/10
【公開號】CN105648055
【申請號】
【發明人】龔建森, 莊林林, 陸光武, 王成明, 沈海玉, 盛中偉, 張笛, 張林吉, 束婧婷, 俞燕, 劉加圣, 竇新紅, 徐步, 鄒劍敏
【申請人】江蘇省家禽科學研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月15日