L，酵母膏5g/L，化C1 lOg/L，其余為水，pH7.2-7.4，12rC滅菌20min)中，恒 溫30°C振蕩培養24小時;得到細菌培養液。
[0025] 采用甘油保藏法，在滅菌的菌種管中，加入l.OmL細菌培養液，0.5ml 50% (體積濃 度）的甘油，混勻后于-86 °C冰箱保存。
[0026] 將該菌株保藏于中國典型培養物保藏中屯、;保藏地址為中國，武漢，武漢大學;保 藏日期:2014年5月5日，保藏編號為CCTCCN0:M2014182。
[0027] 實施例二:枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl鑒定 [00%]菌株的形態特征形態特征見圖1。
[0029] 菌株的顯微形態特征見圖2。
[0030] 16S rDNA序列分析:采用通用引物進行菌落PCR擴增16S rDNA序列。上游引物27f: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物 1492r:5'-GGT TAC CTT GTTT ACG ACT T-3'。反 應體系如下：
[0031]
[0032] 反應條件：94。(：預變性5111111，94。(：變性1111111，55。(：退火1111111，72。(：延伸9〇3,33個循 環，最后72°C延伸SmiruPCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑取1500bp左右的條帶進行凝 膠回收，送上海生工測序。
[0033] 將測得的序列在GenBank中進行Blast比對，并選取同源性較高的菌株的序列用 MEGA4.1軟件構建16S rDNA系統發育樹。
[0034] 實施例枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl發酵液的制備
[0035] 菌種活化:取保存-86°C冰箱的枯草芽抱桿菌菌株菌種接種于LB液體培養基中，30 °C下，200rpm振蕩培養12小時，作為種子培養液。
[0036] 菌株發酵:將上述種子液W5% (V/V)濃度接種于LB液體培養基中，30°C下，200rpm 振蕩培養18小時，獲得發酵液，離屯、獲得發酵液上清液。
[0037] 實施例四：枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl發酵液對水稻葉白枯病原菌括 抗作用
[0038] 濾紙片法檢測發酵液的對水稻葉白枯病原菌抑菌活性。將水稻葉白枯病原菌接種 LB斜面，37 °C培養24小時，加入2mL無菌水制成菌懸液，取ImL菌懸液加入100m化B固體培養 基(45°C左右)混勻，倒入培養皿，在無菌條件下取出各2(Κ)化發酵液、無菌水和氨節青霉素 (濃度為50yg/mL)滴加于直徑10mm的無菌濾紙，用無菌綴子在每個培養皿放四個濾紙片，無 菌水為空白對照，氨節青霉素為陽性對照，發酵液設置兩個平行，每個平板做3個重復，放入 培養箱恒溫倒置37Γ培養2地。觀察抑菌作用，測量抑菌圈直徑大小。
[0039] 結果見圖3。
[0040] 實施例五:枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)MSl發酵液對魔芋軟腐病原菌括抗 作用
[0041] 濾紙片法檢測發酵液的對魔芋軟腐病原菌抑菌活性。將魔芋軟腐病原菌接種LB斜 面，37°C培養24小時，加入2mL無菌水制成菌懸液，取ImL菌懸液加入lOOmL LB固體培養基 (45°C左右)混勻，倒入培養皿，在無菌條件下取出各20化L發酵液、無菌水和氨節青霉素(濃 度為50yg/mL)滴加于直徑10mm的無菌濾紙，用無菌綴子在每個培養皿放四個濾紙片，無菌 水為空白對照，氨節青霉素為陽性對照，發酵液設置兩個平行，每個平板做3個重復，放入培 養箱恒溫倒置37°C培養2地。觀察抑菌作用，測量抑菌圈直徑大小。
[0042] 結果見圖4。
[0043] 序列表
[0044] _
[0045] 序列表
[0046] SEQ ID N0：1
[0047]
【主權項】
1. 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)MSl，于2014年5月5日保藏于中國典型培養物保 藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2014182,保藏地址為湖北，武漢，武漢大學。2. -種生物防治植物病害的菌劑，其活性成分為枯草芽孢桿菌或其發酵液。3. 權利要求2所述的生物防治植物病害的菌劑在防治魔芋軟腐病或水稻白葉枯病上的 應用。4. 一種生物農藥，其含有權利要求1的枯草芽孢桿菌或其發酵液或權利要求2所述的菌 劑。5. 權利要求4所述的生物農藥在拮抗魔芋軟腐病上的應用。6. 權利要求4所述的生物農藥在防治水稻白葉枯病病原菌上的應用。7. 權利要求1所述的枯草芽孢桿菌、權利要求2所述的菌劑或權利要求4所述的生物農 藥在植物病害生物防治中的應用，其中所述的植物病害是魔芋軟腐病、水稻白葉枯病。8. 權利要求1所述的枯草芽孢桿菌或權利要求2所述的菌劑在制備生物農藥中的應用， 其中所述的生物農藥抑制魔芋軟腐病、水稻白葉枯病。9. 權利要求2-8任一項所述的枯草芽孢桿菌發酵液，其特征在于，制備方法如下： 1) 菌種活化:取保存于-86 °C冰箱的枯草芽孢桿菌菌株菌種接種于LB液體培養基中，30 °C下，200rpm振蕩培養12小時，作為種子培養液； 2) 菌株發酵:將上述種子液以5%(V/V)濃度接種于LB液體培養基中，30°C下，200rpm振 蕩培養18小時，獲得發酵液，離心獲得上清液，即為發酵液。10. 權利要求1-9任一項所述的枯草芽孢桿菌是從疏花水柏枝的根中獲得的內生真菌。
【專利摘要】本發明公開了一種內生枯草芽孢桿菌及其應用。該枯草芽孢桿菌保藏名稱為<i>Bacillus？subtilis？</i>MS1；保藏單位：中國典型培養物保藏中心；保藏地址為中國，武漢，武漢大學；保藏日期：2014年5月5日，保藏編號為CCTCC？NO：M？2014182。本發明經實驗證明，該內生枯草芽孢桿菌發酵液對植物病害魔芋軟腐病、水稻白葉枯病病原菌有較強的抑制作用，可用于制備防治魔芋軟腐病、水稻白葉枯病的生物菌劑，為開發新的生物農藥品種、植物生物防治菌劑提供了新選擇，具有一定的經濟和社會效益。CCTCC NO：M 201418220140505
【IPC分類】A01N63/00, A01N63/02, A01P1/00, C12N1/20, C12R1/125
【公開號】CN105670954
【申請號】
【發明人】劉士平, 蔣維, 孔玉珊, 秦王閣閣, 李淵韜, 薛艷紅, 高媛
【申請人】三峽大學
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年1月20日