max（最大耗氧量）的檢測試劑盒和方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因檢測，具體涉及最大耗氧量相關基因檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] VOzMAX是人每公斤體重每分鐘可W使用氧量的毫升數。該指數通常用于衡量人體 有氧運動能力的高低W及評估專業的耐力運動員的訓練效果。體能越強的人，VOzMAX越 高，可W達到的運動強度越大。最大耗氧量的生理局限，取決于：1肌肉細胞組織利用氧 氣分解燃料的化學能力。2必血管和肺系統為肌肉組織輸送氧氣的綜合能力。
[0003] 人體最大攝氧量的測試有幾種方法，主要包括了；直接測試法、間接測試法、Bruce 方法和12分鐘跑等。送些方法都需要借助相應的儀器和專業人員才能完成。而VO2MAX受 到環境、年齡、性別、訓練和遺傳等因素的影響。自1971年起，多國科學家發現VOzMAX的遺 傳度可W高達93. 4%，VOzMAX與遺傳的關系十分密切，可訓練性即訓練使VOzMAX提高的可能 性較小，一般為20% - 25〇/〇。
[0004] 而目前的方法都無法評估個最大攝氧量的水平，送也就導致了個體對自身有氧運 動能力的認識不清，進而會采取錯誤的健身方案。而對于我國的專業體育運動員來講，如果 在青少年選材和后續的訓練培養階段沒有考慮VOzMAX的高遺傳度，將會導致漏選極有潛力 的人才，造成我國體育事業無法估量的損失。
【發明內容】
[0005] 有鑒于此，本發明提供了一種人體最大攝氧量的基因檢測試劑盒，該試劑盒對受 巧||者的相關基因進行檢測，分析得到其VOzMAX的遺傳因素，且PCR擴增反應在同一臺PCR儀 上同步進行并具備檢測的高效性、特異性。
[0006] -種VOzMAX基因檢測試劑盒，包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，存放的試劑包 括： (1)針對4個基因 SNP多態位點的PCR反應引物組：
(3)瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。
[0007] 本發明提供的最大攝氧量基因檢測試劑盒的有益效果是：通過PCR引物的設計使 多個PCR擴增反應在同一臺PCR儀上同步進行，對受測者的相關基因進行檢測，并實現檢測 的高效性、特異性，分析得到其最大攝氧量的遺傳因素，從而為受測者獲得一個合適的健身 運動方案，為專業體育運動機構提供科學的選材依據，制定合理的訓練培養計劃。
【附圖說明】
[0008] 圖1是反應產物瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0009] 最大攝氧量基因檢測試劑盒，包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，存放的試劑包 括： (1)針對4個基因 SNP多態位點的PCR反應引物組：
(3)瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。
[0010] 下面將結合實施例對本發明提供的方法予W進一步的說明。
[0011] 本實施例對測試個體采用最大攝氧量基因檢測試劑盒同時檢測4個基因的SNP 多態位點，并根據基因分型結果，評估其最大攝氧量水平，從而更加科學合理的制定健身運 動方案。
[0012] 使用到的最大攝氧量檢測試劑盒內試劑由W下組成： (1) 針對8個基因 SNP多態位點的PCR反應引物組：
(2) PCR擴增試劑；10XPCR緩沖液，該PCR緩沖液為lOOmM Tris-肥1 P冊.3,500mM KC1，15mM MgClz ;dNTPs混合物，該dNTPs混合物為Η磯酸鳥嘿嶺脫氧核巧酸dGTP，Η磯 酸腺嘿嶺脫氧核巧酸dATP，Η磯酸胸腺嚼巧脫氧核巧酸dTTP，Η磯酸胞嚼巧脫氧核巧酸 dCTP四種核巧酸，各組分濃度為2. 5mM ;5υ/μ 1熱啟動Taq酶。
[001引（3)瓊脂糖凝膠電泳分析試劑諒脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標準、Goldview 染色液和DM上樣緩沖液，該緩沖液W漠酪藍為指示劑稀釋至IX后使用。
[0014] 使用上述最大攝氧量基因檢測試劑盒按如下步驟進行檢測： (1)提取樣本基因組DM。
[0015] 采集該測試者唾液，向l-2ml唾液樣品中加入500ul提取緩沖溶液，該DM提取 緩沖溶液溶劑為50mM的化is-肥1 pH7. 4、0. 5mM的邸TA和50mM的化C1，反復吹打混勻 后，SOOOXg離必5分鐘，棄去上清，此步驟重復一次；得到的沉淀中加入500ul裂解液， 該裂解液溶劑為 50mM Tris-肥 1 pH7. 4,50mM Tris-肥 1 pH7. 4，150mM 化Cl，lmM 邸TA，1% Triton x-100，l% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS,蛋白酶 K20mg/mL,徹底懸浮沉淀并 充分混勻后，室溫放置30分鐘，期間來回顛倒離必管數次；得到的混合液中，加入濃度為 lOmg/mLRNA酶的水溶液10 μ L，37°C下靜置lOmin ;得到的上清液中，加入等體積苯酪-氯 仿混合溶液，苯酪和氯仿體積比為1 : 1，充分混勻，混合液4°C，12000 X g離必5分鐘，上清 液移入干凈離必管內；加入等體積苯氛-氯仿-異戊醇混合溶液，苯酪、氯仿和異戊醇體積 比為25 : 24 : 1，充分混勻后，4°C，12000Xg離必5分鐘，上清液移入干凈離必管內；加 入等體積氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，4°C，12000Xg離必5分鐘，上清液移入干 凈離必管內；加入0. 6倍體積的冰浴異丙醇溶液及0. 1倍的3mol/L醋酸鋼溶液，-2(TC靜 置60分鐘后，4°C，12000 X g離必10分鐘，棄上清液；得到的沉淀物中加入0. 5血70 %己醇 清洗沉淀物，4°C，12000 X g離必5分鐘，棄上清液，此步驟重復一次；得到的沉淀物自然風 干，加入20 μ L無菌超純水回溶，電泳檢測，-2(TC保存。
[001 引（2)PCR 擴增。
[0017]本實施例同時檢測 rsl042713、rsl205、rs8192678 和 rs2010963,每個 SNP 的檢測 需要一對上下游引物、兩條多態引物共4條PCR引物，共需要16條引物。每個SNP的檢測 需要做兩管PCR擴增，為防止出現假陽性之類的反應，衡量PCR是否成功，加設一管陰性對 照組，共做9管PCR，所述陰性對照組基因組模板及反應體系是一樣的，但沒有引物存在。 [001引根據不同的檢測位點，用相應的引物按如下比例分別配制PCR反應體系： 2.5μ 110XPCR緩沖液，2μ 1 dNTPs，0.5u 1引物組，熱啟動Taq酶0. 15μ 1，基因組模板 80mg，添加超純水至總體積為25 μ 1。
[0019] 將裝有反應溶液的化pendorf試管放入ΑΒΙ 9700 PCR儀中，設置反應條件如下： 預變性951：3111111;熱循環941：3〇3,6〇1：3〇3,721：3〇3,35個循環；延伸721：3111111。反應 結束后，取出試管。
[0020] 由于9管PCR擴增反應是在同一臺PCR儀上同步進行的，為了實現檢測的高 效性、特異性，要求16條PCR引物的Tm值相近，為此需要先進行大量的DNA序列軟件分析 來設計PCR引物，并通過大量的實驗來進行Tm值的優化并確定設計的合理性，本試劑盒各 基因 SNP多態性的檢測是既相對獨立又相互聯系的，不可分割。
[0021] ( 3 )瓊脂糖凝膠電泳檢測 將擴增后的產物進行瓊脂糖電泳檢測，過程如下；3g瓊脂糖，加入lOOmL去離子水，微 波爐加熱Imin，冷卻到6(TC時加入5 μ L Goldview染色液，制成3%的瓊脂糖凝膠。PCR產 物10 μ L與6 X T邸緩沖液0. 8 μ L混合上樣，電壓100V電泳15min。紫外燈下讀取結果并 拍照，所得瓊脂糖電泳檢測圖如圖1所示。
[0022] 檢測得到4個基因分型分析結果如下：
根據w上分型結果，該測試者具有很好的最大攝氧量，送意味著該人適合耐力相關運 動。如果是專業運動員，則有較大可能在耐力項目，如中長跑中取得好的比賽成績。如果是 普通健身愛好者，則在日常鍛煉中應適當加大有氧運動強度，可W有效起到減肥的效果。
[0023] W上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用W限制本發明，凡在本發明的精神和 原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 最大攝氧量檢測試劑盒，包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，其特征在于：存放的 試劑包括： (1) 針對4個基因 SNP多態位點的PCR反應引物組： 針對SNP rsl042713的引物組： 1 CCTTCTTGCTGGCACCCAATA 2 GTCCGGCGCATGGCTTCC 3 GCTGAGTGTGCAGGAC 4 CCAGTGAAGTGATGAAG 針對SNP rsl205的引物組： 1 GTTTGGCTTCTGTCCTCAC 2 CACATGGAGAGAGAGACTA 3 GCTTTATTGGCTTATAG 4 TCCCTATCTGGAGGATAG 針對SNP rs8192678的引物組： 1 GACGACGAAGCAGACAAGACCA 2 CTGTCCCTCAGTTCACC 3 GAGAGACTTTGGAG 4 AAGAACAAGAAGGAGAC 針對SNP rs2010963的引物組： 1 GTGCGAGCAGCGAAAGC 2 GCACTTTGCCCCTGTCC 3 AGCGGACTCACCGGCCAG 4 GGGCTCACGCCGCGCTC (2) PCR擴增試劑； (3) 瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。2. 根據權利要求1所述的最大攝氧量檢測試劑盒，其特征在于：所述引物用量均為 0· 5_1· Ο u 1 〇3. 根據權利要求1所述的最大攝氧量檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴增試劑包 括：10XPCR緩沖液，dNTPs，熱啟動Taq酶，基因組模板。4. 根據權利要求3所述的最大攝氧量檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR緩沖液包含： lOOmM Tris-HCl pH8.3,500mM KCl，15mM MgCl2。5. 根據權利要求3所述的最大攝氧量檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴增試 劑用量為：l〇XPCR緩沖液2. 5μ 1，dNTPs2l·! 1，熱啟動Taq酶0. 1-0. 2μ 1，基因組模板 50-100ng〇6. 根據權利要求1所述的最大攝氧量檢測試劑盒，其特征在于：所述瓊脂糖凝膠電泳 分析試劑包括：瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標準、DNA無毒染料和DNA上樣緩沖液。7. 根據權利要求6所述的最大攝氧量檢測試劑盒，其特征在于：所述DNA無毒染料優 選Biotium Gelred無毒染料。8. 根據權利要求1所述的最大攝氧量檢測試劑盒，其特征在于：根據測試結果，為受測 者提供最大攝氧量的基因分析，使其了解自身最大攝氧量的潛力，合理運用在日常訓練或 鍛煉當中。
【專利摘要】本發明提供了人體VO2MAX基因檢測試劑盒，該試劑盒包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，試劑包括：（1）針對4個基因SNP多態位點的PCR反應引物組（2）PCR擴增試劑（3）瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。本發明通過PCR引物的設計使多個PCR擴增反應可在同一臺PCR儀上同步進行，對受測者的相關基因進行檢測，并實現檢測的高效性、特異性，分析得到其最大耗氧量的遺傳因素，從而為受測者獲得一個合適的健身運動方案，采取相應的策略避免對其無效甚至是有害的方法。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105671131
【申請號】
【發明人】李則軒, 張舒, 朱軼凡, 邱嘉銘, 別茜, 張靜靜, 范家成, 盧駿
【申請人】武漢白原科技有限公司, 湖北省體育科學研究所
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年11月17日