一種檢測人類cox-1基因多態性的試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物醫學領域臨床檢測技術中的基因檢測技術，特別設及一種檢測人 類C0X-1基因多態性的試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 環氧化物水解酶(cyclo-0巧gen-ase，C0X)，是前列腺素(PGs)合成所必須的酶，也 是PGs合成初始步驟中的關鍵性限速酶。C0X有兩種同工酶C0X-1和C0X-2dC0X-1為結構型被 稱為要素酶或管家酶，主要存在于血管、胃、腎等組織中，國內、外學者普遍認為它產生的PG 參與機體正常生理過程和保護功能，如維持胃腸黏膜完整性、調節血小板功能和腎血流。人 體C0X-1基因位于染色體9q32~9q33.3上，長約22化，包含11個外顯子，共編碼576個氨基 酸。C0X-1基因單核巧酸多態性現象(如rsl330344號），可引起堿基替換及啟動子連接部位 的變化，顯著影響內含子或外顯子的功能，改變C0X-1蛋白的構像，使其對作用藥物(阿司匹 林等)產生的抵制效果的敏感性極不均一。
[0003] 在本發明作出之前，目前進行基因突變檢測的方法有數十種。金標準法為基因測 序法。基因測序法是目前應用最廣泛、較準確的一種方法，但是該方法需要昂貴的儀器設備 和專業的人員進行操作，費時費力，在臨床上很難進行推廣。基因忍片法具有快速高通量的 優點，但是操作上復雜，步驟多，成本高也不易普及。W限制性酶切片段長度多態性(RFLP) 檢測基因突變的方法具有成本低廉的優點，但是過程煩瑣，時間長也不適合普及。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種檢測人類C0X-1基因多態性的試劑 盒及其應用。
[0005] 本發明的技術方案是：
[0006] -種檢測人類C0X-1基因多態性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內的物質，其主要 技術特征在于:所述盒體內的物質包括檢測C0X-1基因上的rsl330344號SNP位點的特異性 引物及特異性巧光探針、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCb溶液、巧光定量PCR反應緩沖液 和去離子水；
[0007] 所述特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為：
[000引 正義引物：5 ' -CTTGTTTAAGGTCACGCTATGG-3 '，
[0009] 反義引物：5'-6了60：了0：了6(：了64(：170：-3'；
[0010] 所述特異性巧光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為：
[0011] 野生型探針：5 ' -FAM-AGGCTCTTCCCATGAGT-MGB-3 '
[0012] 突變型探針：5' -HEX-AGGCTCTTCCCATAAGT-MGB-3'。
[0013] 所述盒體中各物質的含量為:濃度為ΙΟμΜ的特異性引物共0.45μ1，其中正義引物 和反義引物各0.22扣1;濃度為扣Μ的特異性巧光探針共0.化1，其中野生型探針和突變型探 針各0.化1;濃度為5單位/μ1的化q DNA聚合酶0.02μ1;濃度為20mM的dNTP混合液0.化1;濃 度為25mM的MgC12溶液ο.化1; 5X巧光定量PCR反應緩沖液化1;去離子水4.73μ1。
[0014] 所述特異性引物中，正義引物的Tm值為57°C，反義引物的Tm值為57.rC;所述特異 性巧光探針中，野生型探針的化值為69°C，突變型探針的化值為69°C。
[0015] 所述試劑盒的保存溫度為-2(TC。
[0016] 本發明另一技術方案是：
[0017] -種檢測人類C0X-1基因多態性的試劑盒的應用，其物征在于:所述試劑盒用于檢 測C0X-1基因上rsl330344號SNP位點的基因型。
[0018] 本發明與現有技術相比，優點在于檢測準確性高、檢測簡單方便、檢測時間短、結 果分析簡單的優點，適合臨床實驗室使用：
[0019] (1)利用本發明試劑盒能夠對C0X-1基因多態性位點進行定性檢測，根據SNP位點 進行PCR巧光擴增反應，只需根據兩種不同的巧光曲線是否起線就能進行結果判斷，不會產 生人為誤差，假陽性和假陰性率低，提高效率降低檢測成本。
[0020] (2)無需DNA提取，只需裂解全血細胞，將細胞裂解后的懸液加入反應體系即可完 成擴增，免去DNA提取的步驟和成本并避免氣溶膠污染，提高檢測效率和準確度，縮短檢測 時間。
[0021] (3)本發明試劑盒所使用的巧光檢測探針為Taqman探針，該探針費用低廉；同時本 發明所有的反應全程閉管操作，PCR反應后不需要進行PCR產物純化、電泳、酶切、雜交等，在 節省了檢測成本的同時，大大縮短了檢測周期，提高了檢測的效率，另外降低了 PCR產物污 染引起假陽性的風險。
【附圖說明】
[0022] 圖1--C0X-1基因上rsl330344號SNP位點純合野生型擴增曲線示意圖。
[0023] 圖2--C0X-1基因上rsl330344號SNP位點雜合型擴增曲線示意圖。
[0024] 圖3--C0X-1基因上rsl330344號SNP位點純合突變型擴增曲線示意圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在W本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。
[0026] -種檢測人類C0X-1基因多態性的試劑盒，試劑盒中包括W下C0X-1基因上 rsl330344號SNP位點的擴增特異性引物1對及2條特異性巧光探針。
[0027] 用于C0X-1基因上rsl330344號SNP位點檢測的特異性引物中的正義引物和反義引 物的序列為：
[0028] 正義引物：5 ' -CTTGTTTAAGGTCACGCTATGG-3 '，
[00 巧]反義引物：5'-6了60：了0：了6(：了64(：170：-3'；
[0030] 所述特異性巧光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為：
[0031] 野生型探針：5 ' -FAM-AGGCTCTTCCCATGAGT-MGB-3 '
[0032] 突變型探針：5' -HEX-AGGCTCTTCCCATAAGT-MGB-3'。
[0033] 所述的一種檢測人類COX-1基因位點多態性的試劑盒，還包括化qDNA聚合酶、dNTP 混合液、MgCl2溶液、巧光定量PCR反應緩沖液和去離子水。
[0034] 所述的野生型特異性巧光探針為化qman探針，該探針5'端的巧光基團為FAM，3'端 的澤滅基團為MGB。
[0035] 所述的突變型特異性巧光探針為化qman探針，該探針5 '端的巧光基團為肥X，3 '端 的澤滅基團為MGB。
[0036] 試劑盒組成
[0037] 試劑盒的配置成份配合配置，使用時僅需加入樣本即可完成實驗配置，此種配置 更為方便快捷，為優選配置。
[0038] 配合反應液成份組成：
[0039] '[0040]~使用試劑盒的操作步驟
' '
[0041 ]步驟1:全血細胞裂解液的制備
[0042] 取受檢者外周靜脈血30化1，加入70化1細胞裂解液，顛倒混勻5次，12000rpm離屯、1 分鐘，倒去上清，并將離屯、管倒置在干凈的吸水紙上停留2分鐘，確保沉淀在管中，加入30化 1雙蒸水，滿旋震蕩混勻成細胞裂解懸液。
[0043] 步驟2:巧光定量PCR反應
[0044] 巧光定量PCR反應體系總體積為10μ1，包括:濃度為20ngAil的細胞裂解懸液化1、 濃度為lOliM的特異性引物共0.45μ1，其中正義引物和反義引物各0.22化1;濃度為扣Μ的特 異性巧光探針共0.化1，其中野生型探針和突變型探針各0.化1;濃度為5單位/μ1的化q DNA 聚合酶0.02μ1;濃度為20mM的dNTP混合液0.化1;濃度為25mM的MgC12溶液0.化1; 5X巧光定 量PCR反應緩沖液化1;去離子水4.73μ1。
[0045] 在ΑΒΙ 7500型巧光定量PCR儀上進行反應，反應條件為：50°C下2min，95°C下 lOmin，再進行40~55個PCR循環(92°C下15s，57 °C下Imin)，反應結束后在ABI 7900HT型巧 光定量PCR儀讀取巧光量。
[0046] 步驟3:基因型分析及確定基因型
[0047] 采用ABI 7500型巧光定量PCR儀自帶軟件SDS(Sequence Detection Systems) V2.0,根據檢測反應管中的FAM巧光和肥X巧光PGR曲線，判斷COX-1基因上rsl330344號SNP 位點的分型，分型的具體依據見下表。
[004引 C0X-1基因上rsl330344號SNP位點分型依據
[0049] _
[0050] 如圖1所示，巧光定量PCR擴增曲線僅FAM巧光起線，皿X巧光不起線，為COX-1基因 上rsl330344號SNP位點純合野生型。
[00川如圖2所示，巧光定量PCR擴增曲線FAM和皿X 2條巧光都起線，為C0X-1基因上 rsl330344號SNP位點雜合型。
[0052] 如圖3所示，巧光定量PCR擴增曲線僅僅皿X巧光起線，FAM巧光不起線，為C0X-1基 因上rsl330344號SNP位點純合突變型。
[0053] 顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的實例，而并非對實施方式的限制。對 于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可W做出其它不同形式的變化或 變動。運里無需也無法對所有的實施方式予W窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變 動仍處于本發明創造的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種檢測人類cox-ι基因多態性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內的物質，其特征在 于:所述盒體內的物質包括檢測C0X-1基因上的rsl330344號SNP位點的特異性引物及特異 性熒光探針、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子 水； 所述特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為： 正義引物：5 ' -CTTGTTTAAGGTCACGCTATGG-3 '， 反義引物：5 ' -GTGCCTCCTGCTGACTTCC-3 ' ； 所述特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為： 野生型探針：5 ' -FAM-AGGCTCTTCCCATGAGT-MGB-3 ' 突變型探針：5 ' -HEX-AGGCTCTTCCCATAAGT-MGB-3 '。2. 如權利要求1所述的一種檢測人類C0X-1基因多態性的試劑盒，其特征在于:所述盒 體中各物質的含量為：濃度為1〇μΜ的特異性引物共0.45μ1，其中正義引物和反義引物各 0.225μ1;濃度為5μΜ的特異性熒光探針共0.2μ1，其中野生型探針和突變型探針各0. ΙμL;濃 度為5單位/μL的Taq DNA聚合酶0.02μ1;濃度為20mM的dNTP混合液0 . ΙμL;濃度為25mM的 MgC12溶液0.5μ1; 5X熒光定量PCR反應緩沖液2μ1;去離子水4.73μ1。3. 如權利要求1所述的一種檢測人類C0X-1基因多態性的試劑盒，其特征在于:所述特 異性引物中，正義引物的Tm值為57°C，反義引物的Tm值為57.1°C ;所述特異性熒光探針中， 野生型探針的Tm值為69°C，突變型探針的Tm值為69°C。4. 如權利要求1所述的一種檢測人類C0X-1基因多態性的試劑盒，其特征在于:所述試 劑盒的保存溫度為-20 °C。5. -種檢測人類C0X-1基因多態性的試劑盒的應用，其物征在于:所述試劑盒用于檢測 C0X-1基因上rsl330344號SNP位點的基因型。
【專利摘要】本發明涉及一種檢測人類COX-1基因多態性的試劑盒及其應用。本發明盒體內的物質包括檢測COX-1基因上的rs1330344號SNP位點的特異性引物及特異性熒光探針、Taq？DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水。本發明克服了各種基因突變檢測方法各自存在的缺陷。本發明檢測準確性高、檢測簡單方便、檢測時間短、結果分析簡單的優點，適合臨床實驗室使用，能夠對COX-1基因多態性位點進行定性檢測，根據SNP位點進行PCR熒光擴增反應，只需根據兩種不同的熒光曲線是否起線就能進行結果判斷，不會產生人為誤差，假陽性和假陰性率低，提高效率降低檢測成本。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105671143
【申請號】
【發明人】徐運, 邵淵, 張希根
【申請人】南京仁天生物科技有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2015年9月10日