一種檢測人類pear1基因多態性的試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物醫學領域臨床檢測技術中的基因檢測技術，特別設及一種檢測人 類PEAR1基因多態性的試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 血小板內皮聚集受體1 (PEAR1 )，一種新發現跨膜蛋白，參與了誘導血小板接觸性 激活過程。膠原作用于血小板之后，PEAR1胞質內酷氨酸及絲氨酸殘基憐酸化，從而使相互 接觸的血小板形成更稱穩定的血栓。PEAR1可W同時調節CRP-)(L和二憐酸腺巧(adenosine diphos地ate，ADP)形成通路，通路與陽AR1基因的rs2768759號和rsl2041331兩個SNP位點 相關，其基因多態性均可能影響抗血小板聚集藥物（如阿司匹林等）的抗血小板作用。通過 對PEAR1基因多態性的檢測，可W更好的了解患者對抗血小板聚集藥物的治療效果。
[0003] 在本發明作出之前，目前進行基因突變檢測的方法有數十種。金標準法為基因測 序法。基因測序法是目前應用最廣泛、較準確的一種方法，但是該方法需要昂貴的儀器設備 和專業的人員進行操作，費時費力，在臨床上很難進行推廣。基因忍片法具有快速高通量的 優點，但是操作上復雜，步驟多，成本高也不易普及。W限制性酶切片段長度多態性(RFLP) 檢測基因突變的方法具有成本低廉的優點，但是過程煩瑣，時間長也不適合普及。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑 盒及其應用。
[0005] 本發明的技術方案是：
[0006] -種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內的物質，其主要 技術特征在于:所述盒體內的物質包括檢測PEAR1基因上的rs2768759號位點的特異性引物 及特異性巧光探針、rsl2041331號SNP位點的特異性引物及特異性巧光探針、Taq DNA聚合 酶、dNTP混合液、MgCh溶液、巧光定量PCR反應緩沖液和去離子水；
[0007] 所述PEAR1基因上的rs2768759號位點特異性引物中的正義引物和反義引物的序 列為：
[000引正義引物：5 ' -CCACCCTCAGCCCTATCACT-3 '，
[0009] 反義引物:5 ' -AGATTGAATCATGGGAGTGGG-3 ' ；
[0010] 所述PEAR1基因上的rsl2041331號位點特異性巧光探針包括野生型探針和突變性 換針，它們的序列為：
[0011] 野生型探針：5 ' -FAM-CACCTGTCCAGTTCC-MGB-3 '
[0012] 突變型探針：5' -HEX-CACCTGTCCCGTTCC-MGB-3' ；
[OOU]所述陽AR1基因上的rsl204133巧位點特異性引物中的正義引物和反義引物的序 列為：
[0014]正義引物：5 ' -GGTGAGGGGTTATCCTATGCTAC-3 '，
[0015] 反義引物：5 ' -GATTAGAGTTCCTGGTGGACAAGA-3 ' ；
[0016] 所述PEAR1基因上的rs2768759號位點特異性巧光探針包括野生型探針和突變性 換針，它們的序列為：
[0017] 野生型探針：5 ' -FAM-TCTCACTTCCATCACC-MGB-3 '
[001 引突變型探針：5 ' -HEX-TCTCACTTCCGTCACC-MGB-3 '。
[0019] 所述盒體中各物質的含量為:濃度為ΙΟμΜ的特異性引物共0.45μ1，其中正義引物 和反義引物各0.22扣1;濃度為扣Μ的特異性巧光探針共0.化1，其中野生型探針和突變型探 針各0.化1;濃度為5單位/μ1的化q DNA聚合酶0.02μ1;濃度為20mM的dNTP混合液0.化1;濃 度為25mM的MgC12溶液0.化1; 5X巧光定量PCR反應緩沖液化1;去離子水4.73μ1。
[0020] 所述檢測rs2768759號位點特異性引物中，正義引物的Tm值為58.4°C，反義引物的 Tm值為58.3°C ;所述特異性巧光探針中，野生型探針的Tm值為69°C，突變型探針的化值為68 °C;所述檢測rsl2041331號位點特異性引物中，正義引物的化值為58.7°C，反義引物的Tm值 為59. rC ;所述特異性巧光探針中，野生型探針的化值為66Γ，突變型探針的化值為66Γ。 [0021 ]所述試劑盒的保存溫度為-20°C。
[0022] 本發明另一技術方案是：
[0023] -種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒的應用，其物征在于:所述試劑盒用于檢 測PEAR1基因上rs2768759號和rsl2041331號SNP位點的基因型。
[0024] 本發明與現有技術相比，優點在于檢測準確性高、檢測簡單方便、檢測時間短、結 果分析簡單的優點，適合臨床實驗室使用：
[00巧](1)利用本發明試劑盒能夠對陽AR1基因 rs2768759號和rsl2041331號兩個多態性 位點進行定性檢測，根據SNP位點進行PCR巧光擴增反應，只需根據兩種不同的巧光曲線是 否起線就能進行結果判斷，不會產生人為誤差，假陽性和假陰性率低，提高效率降低檢測成 本。
[0026] (2)無需DNA提取，只需裂解全血細胞，將細胞裂解后的懸液加入反應體系即可完 成擴增，免去DNA提取的步驟和成本并避免氣溶膠污染，提高檢測效率和準確度，縮短檢測 時間。
[0027] (3)本發明試劑盒所使用的巧光檢測探針為Taqman探針，該探針費用低廉；同時本 發明所有的反應全程閉管操作，PGR反應后不需要進行PCR產物純化、電泳、酶切、雜交等，在 節省了檢測成本的同時，大大縮短了檢測周期，提高了檢測的效率，另外降低了 PCR產物污 染引起假陽性的風險。
【附圖說明】
[002引圖1--PEAR1基因上rs2768759號SNP位點純合野生型擴增曲線示意圖。
[0029] 圖2--PEAR1基因上rs2768759號SNP位點雜合型擴增曲線示意圖。
[0030] 圖3--PEAR1基因上rs2768759號SNP位點純合突變型擴增曲線示意圖。
[0031] 圖4--PEAR1基因上rsl2041331號SNP位點純合野生型擴增曲線示意圖。
[0032] 圖5--PEAR1基因上rsl2041331號SNP位點雜合型擴增曲線示意圖。
[0033] 圖6--PEAR1基因上rsl2041331號SNP位點純合突變型擴增曲線示意圖。
【具體實施方式】
[0034]下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在W本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。
[003引一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒，試劑盒中包括W下PEAR1基因 rs2768759號和rsl2041331號兩個多態性位點的擴增特異性引物1對及2條特異性巧光探 針。
[0036] 用于檢測PEAR1基因上的rs2768759號位點特異性引物中的正義引物和反義引物 的序列為：
[0037] 正義引物：5'-0：4〔0：1^46〔0：了41^4(：1'-3'，
[0038] 反義引物：5 ' -AGATTGAATCATGGGAGTGGG-3 ' ；
[0039] 用于檢測陽AR1基因上的rsl2041331號位點特異性巧光探針包括野生型探針和突 變性探針，它們的序列為：
[0040] 野生型探針：5 ' -FAM-CACCTGTCCAGTTCC-MGB-3 '
[0041 ]突變型探針：5 ' -HEX-CACCTGTCCCGTTCC-MGB-3 '。
[0042] 用于檢巧膽EAR1基因上的rsl204133巧位點特異性引物中的正義引物和反義引物 的序列為：
[0043] 正義引物：5 ' -GGTGAGGGGTTATCCTATGCTAC-3 '，
[0044] 反義引物：5 ' -GATTAGAGTTCCTGGTGGACAAGA-3 ' ；
[0045] 用于檢測PEAR1基因上的rs2768759號位點特異性巧光探針包括野生型探針和突 變性探針，它們的序列為：
[0046] 野生型探針：5 ' -FAM-TCTCACTTCCATCACC