使用小分子從人多能干細胞產生內分泌祖細胞的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及從人多能干細胞例如人胚胎干細胞和誘導多能干細胞產生內分泌祖 細胞的方法。
[0002] 發明背景 0細胞移植潛在地提供了 I型糖尿病的最終治療。然而，供體β細胞有限的可用性制約了 該治療作為臨床治療的用途。
[0003] 多能干(PS)細胞可無限增殖和分化為多種細胞類型；因此，1?細胞為有希望的β細 胞來源。然而，在PS細胞可用于治療糖尿病前，其需要有效和可重復地分化為膜β細胞。在脊 椎動物胚胎發育期間，多能細胞產生Ξ個胚層:外胚層、中胚層和內胚層。
[0004] 對于形成內胚層衍生組織例如膜組織，定形內胚層(DE)的誘導是第一步。從DE細 胞產生膜內胚層(ΡΕ)為產生產膜島素的β細胞所必需的。具有成為內分泌祖細胞化Ρ)潛能 的ΡΕ細胞特征在于兩個重要轉錄因子PDX1和ΝΚΧ6.1的共表達。
[0005] 對于從PS細胞產生膜細胞已經建立了分步體外分化方案。
[0006] 運些方案一般模擬膜發育的主要事件，其包括幾個階段例如DE、原腸、后前腸、ΡΕ、 ΕΡ和最后完全分化的膜β細胞的形成。
[0007] -些科學論文中描述的方案例示了用于從人胚胎干化ES)細胞和誘導多能干 (iPS)細胞獲得膜(-樣)細胞的方案(Aoi等2008; D'Amour等2006; Jiang等2007; Kroon等 2008; Takahashi等2007; Takahashi & Yamanaka 2006;和Wernig等2007)。
[000引迄今為止，hES細胞的有效DE分化已通過激活蛋白A和Wnt處理實現。DE細胞可使用 視黃酸（RA) (Cai等2010; D'Amour等2006)和BMP抑制劑化unisada等2012; Schulz等 2012; Zhang等2009)進一步分化為陽細胞。
[0009] 在產生膜β細胞的途徑中產生陽細胞之后的下一個步驟為產生表達NGN3和NKX2.2 標志物的ΕΡ細胞。
[0010] Nostro等（2012)和Kunisada等（2011)描述了用于將陽分化為ΕΡ的方法。
[0011] 然而，存在對更有效的將PE分化為EP的方法的需求。
[0012] 發明概述 本發明提供改進的用于通過組合已知方案的特征從而增加 NGN3/NKX2.2雙陽性細胞的 百分比將膜內胚層(PE)分化為內分泌祖巧P)細胞的方法。通過向前述方法添加小分子所述 百分比可進一步增加。小分子的某些組合允許NGN3/NKX2.2雙陽性百分比的進一步有利增 加。
[0013] 本發明進一步設及通過本發明方法可獲得的EP細胞。
[0014] 本發明進一步設及所述細胞尤其在治療I型糖尿病中的醫學用途。
[0015] 本發明采用一種替代方法W改進人PE細胞向完全分化的β細胞分化的效率，即通 過提供增加 NGN3/NKX2.2雙陽性細胞化Ρ細胞定型為內分泌細胞命運的標志物)百分比的方 法。
[0016] 在一個實施方案中，本發明提供改進的膜β細胞前體群，即，NGN3/NKX2.2雙陽性細 胞的百分比增加的EP細胞。
[0017] 在另一個實施方案中本發明提供更均質的EP細胞群，運對于運些細胞向完全分化 的膜β細胞進一步發育是重要的。
[0018] 在另一個實施方案中，本發明還提供更同步的ΕΡ群，W到達分化的下一階段，即葡 萄糖響應的完全分化的β細胞。
[0019] 在一方面，本發明提供用于獲得NGN3/NKX2.2雙陽性內分泌祖細胞的方法，其中將 包含膜內胚層細胞的細胞群暴露于基礎培養基中的TGF-β I型受體抑制劑和BMP括抗劑和 腺巧酸環化酶激活劑和煙酷胺。
[0020] 在一方面，本發明提供用于獲得NGN3/NKX2.2雙陽性內分泌祖細胞的方法，其中將 包含膜內胚層細胞的細胞群暴露于吉非替尼、JNK抑制劑VIII和DAPT。
[0021] 本發明還可解決將從示例性實施方案的公開內容中顯而易見的其它問題。
[0022] 附圖簡述 圖1顯示本發明方法在NGN3 mRNA誘導中的有利作用。
[0023] 圖2顯示本發明方法在產生NGN3/NKX2.2雙陽性內分泌祖細胞中的有利作用。
[0024] 圖3顯示組合本發明小分子的個體作用和有利作用。
[0025] 圖4顯示組合本發明幾種小分子的個體作用和有利作用。
[0026] 發明詳述 本發明設及從人源的多能干細胞例如胚胎干化S)細胞和誘導多能干細胞產生內分泌 祖化P)細胞的方法。
[0027] 干細胞為通過其在單細胞水平自我更新且分化產生子代細胞(包括自我更新祖細 胞、非更新祖細胞和終末分化細胞)的能力而界定的未分化細胞。干細胞特征還在于其體外 從多胚層（內胚層、中胚層和外胚層)分化為各種細胞譜系的功能細胞W及移植后產生多胚 層的組織的能力。
[00%]干細胞按照其發育潛能分為：（1)全能的，意指能夠產生所有胚胎和胚外細胞類 型；（2)多能的（pluripotent)，意指能夠產生所有胚胎細胞類型；（3)多潛能的（multi- potent)，意指能夠產生細胞譜系的子集，但所有均在一種特定組織、器官或生理系統內（例 如，造血干細胞可產生的子代包括HSC (自我更新）、血細胞限制的寡能的祖細胞和為血液 正常組分的所有細胞類型和成分(例如，血小板））；（4)寡能的，意指能夠產生比多潛能干 細胞更受限的細胞譜系子集;和(5)單能的，意指能夠產生單細胞譜系（例如，產生精子的 干細胞）。
[0029] 成熟或分化的膜細胞的確不增殖而的確分泌高水平的膜內分泌激素或消化酶。例 如，完全分化的β細胞響應葡萄糖而分泌高水平的膜島素。當細胞喪失未分化細胞的標志物 或獲得分化細胞的標志物時，出現細胞相互作用變化和成熟。喪失或獲得單個標志物可指 示細胞已經"成熟或完全分化"。
[0030] 本發明采用一種替代方法W改進人ΡΕ細胞向完全分化的β細胞分化的效率，即通 過提供增加 NGN3/NKX2.2雙陽性細胞百分比的方法，所述NGN3/NKX2.2為ΕΡ細胞群的標志 物，所述ΕΡ細胞群是到達產膜島素膜β細胞所必需的細胞階段之一。
[0031] 此外，本發明提供更均質和同步的ΕΡ細胞群，運對于運些細胞向產膜島素的β細胞 進一步發育是重要的。
[0032] 本發明還可解決將從示例性實施方案的公開內容中顯而易見的其它問題。
[0033] 如本文所使用的，"產膜島素細胞"指響應葡萄糖產生和儲存或分泌可檢測量的膜 島素的細胞。"產膜島素細胞"可為單個細胞或細胞集合。
[0034] 如本文所使用的術語"β細胞"指位于膜內稱為膜島的小細胞簇中的細胞。β細胞通 過分泌膚激素膜島素響應高血糖水平，所述膚激素膜島素作用于其它組織W促進從血液吸 收葡萄糖，例如在肝臟中，其中其促進能量經由糖原合成而儲存。
[ΟΟ%] 如本文所使用的。分化(differentiate)"或分化''(differentiationΓ指細胞從 未分化狀態發展至分化狀態，從不成熟狀態發展至較不成熟狀態或從不成熟狀態發展至成 熟狀態的過程。例如，早期未分化的胚胎膜細胞能夠增殖和表達特征標志物，如PDX1、 ΝΚΧ6.1和PTFla。
[0036] 術語"分化因子"指加至ES-或膜前體細胞W促進其分化為EP細胞的化合物。分化 因子還可驅使進一步分化為成熟β細胞。
[0037] 示例性的分化因子包括肝細胞生長因子、角質形成細胞生長因子、毒姍外泌膚 (exendin)-4、堿性成纖維細胞生長因子、膜島素樣生長因子-1、神經生長因子、表皮生長因 子、血小板衍生生長因子、膜高血糖素樣膚1、嗎I噪內酷胺VGndolactam VXIDE1&2和視黃 酸。
[0038] 在一些方面，細胞的分化包括在包含一種或多種分化因子的培養基中培養細胞。
[0039] 在一個實施方案中本發明設及向在其產物中缺乏至少一種膜激素的哺乳動物提 供膜內分泌功能的方法，所述方法包括植入足W在所述哺乳動物中產生可測量的所述至少 一種膜激素的量的通過本發明的任何方法獲得的細胞的步驟。
[0040] 在一個實施方案中，根據本發明方法制備的EP細胞群可用于，例如通過植入需要 此種治療的患者中治療糖尿病。
[0041] 如本文所使用的，術語"人多能干化PS)細胞"指可從任何來源衍生的并且能夠在 適當條件下產生人不同細胞類型（其為所有3個胚層（內胚層、中胚層和外胚層）的衍生物） 子代的細胞。hPS細胞具有在8-12周齡SCID小鼠中形成崎胎瘤的能力和/或在組織培養物中 形成所有Ξ個胚層的可鑒別細胞的能力。人多能干細胞的定義中包括各種類型的胚胎細 胞，包括文獻中人胚泡衍生的干化BS)細胞(常稱作人胚胎干化ES)細胞）。
[0042] 本文中描述的各種方法和其它實施方案可能需要或利用多種來源的hPS細胞。例 如，適用的WS細胞可從發育的胚胎獲得。另外或替代地，合適的WS細胞可從已建立的細胞 系和/或人誘導多能干化iPS)細胞獲得。
[0043] 如本文所使用的術語細胞"指人誘導多能干細胞。
[0044] 如本文所使用的，術語"胚泡-衍生的干細胞"標記為BS細胞，并且人形式稱為"hBS 細胞"。在文獻中該細胞常常被稱為胚胎干細胞，更特別為人胚胎干細胞化ESC)。本發明繼 而使用的多能干細胞因此可為從胚泡制備的胚胎干細胞，如例如W0 03/055992和W0 2007/ 042225中所述，或可為市售可得的hBS細胞或細胞系。然而，進一步設想本發明繼而可使用 任何人多能干細胞，包括分化成體細胞，其通過例如用某些轉錄因子例如0CT4、S0X2、NAN0G 和LIN28處理成體細胞而重編程為多能細胞。
[0045] 如本文所使用的/'EP細胞群"為其中至少