專利名稱：一種海洋真菌培養物的提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種南海紅樹林內生真菌培養物的提取物及其制備方法，以及該提取物在制備抗棉鈴蟲和魚類寄生蟲中華鳋的農藥中的應用。
背景技術：
棉鈴蟲Heliothis armigera(Hühner)是棉花蕾鈴期主要害蟲之一。棉鈴蟲發生期早、為害時間長、發生量大、發生面廣、發生不平衡，世代重疊。適應性強是90年代棉鈴蟲發生重的內因，棉鈴蟲食性雜，除為害棉花外，還能取食玉米、小麥、大豆、花生、果樹、蔬菜等多種植物，繁殖力強，產卵量大，對溫度的適應范圍廣，使棉鈴蟲得以充分利用各種植物資源最大限度地繁衍種群。不合理用藥，棉鈴蟲抗藥性增強，天敵減少，90年代以前棉鈴蟲僅在少數年份發生重，大部分年份發生較輕，發生為害集中，在卵高峰期用藥即可。進入90年代后，棉鈴蟲接連大發生，為害時間長，在卵高峰用藥偏遲，有的甚至完全憑借經驗，有蟲三遍藥，無蟲藥三遍，沒有抓住防治的最佳時期。連續使用同一種或作用機制相同的同一類藥劑，任意加大使用濃度或降低用量，使用次數增多，任意藥劑復配，導致田間較高的藥劑選擇壓力，使抗性種群不斷擴大，棉鈴蟲的抗性增強。過早使用化學農藥，殺傷大量棉鈴蟲天敵，破壞了良好的生態環境，失去了天敵對棉鈴蟲的控制作用，形成了惡性循環。
抗藥性棉鈴蟲是嚴重為害棉花和多種作物的害蟲，近年來在我國長江流域、黃河流域以及新疆等主要產棉區發生量大，并且對常用的3種不同類型化學農藥即有機磷、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類農藥均產生了不同程度的抗性，尤其是對擬除蟲菊酯類農藥的抗性發展速度最快，給有效防治造成了很大困難，使我國的棉花生產遭受了很大損失。因此，從海洋微生物中開發研究生物農藥以防治抗藥性棉鈴蟲具有重要意義。
中華鳋(Sinergasilus spp)是魚的常見嚴重寄生蟲，常常造成魚減產和大批死亡。目前防治此類寄生蟲的藥劑主要是敵百蟲等藥劑。這些藥劑的長期使用已造成寄生蟲對藥劑產生抗藥性。因此，尋找新的生物農藥是當務之急。[潘金培，魚病診斷與防治手冊，上海科技出版社(上海)，1997，P117-126；陳萬義等，新農藥研究與開發，化學工業出版社，(北京)，1995，P121-143]從海洋生物中尋找新的生物農藥，是一種有效的途徑。一個非常成功的例子是日本開發的巴丹，它是從海洋沙蠶毒素發展出來的，是一種高效廣譜的農藥，占日本殺蟲劑總消耗量20％以上，并大量出口。[龍康侯，巫中德，海洋天然產物化學(第一卷)，海洋出版社(北京)，1983，P282]本發明所涉及的海洋真菌是一種紅樹林內生真菌。植物內生真菌(Endophytic fung)生活在高等植物的組織中，對于內生真菌的次級代謝物的研究還較為缺乏，據保守的估計內生真菌的種類繁多，大約有1.5×106種，由于數量龐大，而且與其他生物之間緊密的生態關系，使這類真菌成為潛在的具有產生豐富的次級代謝物的來源。
發明內容
本發明的目的在于提供一種新的具有潛在農藥價值的海洋真菌培養物的提取物及其提取分離方法，以及該提取物在制備抗棉鈴蟲和魚類寄生蟲中華鳋農藥的用途。
本發明所用的海洋真菌是南海紅樹林內生真菌NO1893，該真菌已保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國，武漢大學校內)，保藏號為CCTCCNOM202035，保藏日為2002年9月9日。該真菌以下簡稱為海洋真菌CCTCC M202035。
本發明的海洋真菌培養物提取物，是海洋真菌CCTCC M202035培養物的乙酸乙酯提取物中的有效部分油狀物。
本發明提取物可以從海洋真菌CCTCC M202035的培養物(發酵液)的乙酸乙酯提取物中提取分離而得到。其具體制備方法包括以下步驟a.海洋真菌CCTCC M202035的種子培養培養基(按重量比)葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，瓊脂1-1.5，氯化鈉3-5，水100；制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培養5-7天；b.海洋真菌CCTCC M202035的發酵培養發酵培養基(按重量比)葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，氯化鈉3-5，水100；將斜面中培養好的菌株挑入發酵培養基，于室溫25-35℃靜置1-2月；c.將上述培養好的發酵液過濾除去菌體；d.將發酵液加熱濃縮至原液體積的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進行色譜分離，以乙酸乙酯/石油醚＝15％清洗，然后用乙酸乙酯/石油醚＝50％為洗脫劑洗脫；e.收集50％的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，濃縮得棕色油狀物即為所需的本發明提取物。
實驗證明，本發明的提取物(油狀物)能殺死棉鈴蟲和魚類寄生蟲中華鳋。具體效果可達到1000μg/ml，24hr，100％殺滅棉鈴蟲；1.2μg/ml，48hr，100％殺滅中華鳋。所以，本發明的提取物可用于制備抗棉鈴蟲的農藥和用于制備抗魚類寄生蟲中華鳋的農藥。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例1 本發明提取物——棕色油狀物的分離制備方法a.真菌NO1893的種子培養培養基(按重量比)葡萄糖1，酵母提取物0.1，蛋白胨0.2，瓊脂1，氯化鈉3，水100；制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，35℃培養7天；b.真菌NO1893的發酵培養發酵培養基(按重量比)葡萄糖2kg，酵母提取物0.2kg，蛋白胨0.4kg，氯化鈉6kg，水200L；將斜面中培養好的菌株挑入發酵培養基，于室溫25-35℃靜置1.5月；
c.將上述培養好的發酵液過濾除去菌體；d.將發酵液加熱濃縮至原液體積的50L，用等量乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，得到8g濃縮物，在硅膠柱中進行色譜分離，以乙酸乙酯/石油醚＝15％清洗，然后用乙酸乙酯/石油醚＝50％為洗脫劑洗脫；e.收集洗脫液，濃縮得棕色油狀物3.3g。實施例2 本發明提取物——棕色油狀物殺滅中華鳋和棉鈴蟲活性試驗1.抗棉鈴蟲試驗將實施例1得到的棕色油狀物按1000μg/ml進行系列濃度稀釋，然后均勻地將其噴霧到菜心葉子上，自然晾干后，將人工養殖的2～3齡棉鈴蟲用毛筆接到各處理的葉子上，在26℃的條件下養殖，每24小時調查一次各處理棉鈴蟲的死亡百分率，以無菌水為空白對照，每處理3個重復。結果1000μg/ml，24hr，100％殺滅棉鈴蟲。
2.抗魚類寄生蟲中華鳋的試驗用500ml三角瓶將實施例1得到的棕色油狀物進行系列濃度稀釋，然后將中華鳋接到各處理的三角瓶中，在26℃的條件下養殖，每4小時調查一次各處理中華鳋的死亡百分率，以無菌水為空白對照，每處理3個重復。實驗結果見表1。從表1的結果數據可知本發明提取物對魚類寄生蟲中華鳋具有明顯的殺滅作用，而且存在明顯的量效關系當8μg/ml濃度時，4小時便能100％殺滅害蟲；而從1.2-2μg/ml，則需要48小時；0.8μg/ml，基本無活性.。
表1.本發明提取物對中華鳋的殺滅效果
權利要求
1.一種海洋真菌培養物的提取物，其特征是該提取物是海洋真菌CCTCC M202035培養物的乙酸乙酯提取物中的有效部分油狀物。
2.權利要求1所述提取物的制備方法，其特征是該方法包括以下步驟a.海洋真菌CCTCC M202035的種子培養培養基組成按重量比為葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，瓊脂1-1.5，氯化鈉3-5，水100；制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培養5-7天；b.海洋真菌CCTCC M202035的發酵培養發酵培養基組成按重量比為葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，粗海鹽1.5，水100；將斜面中培養好的菌株挑入發酵培養基，于室溫25-35℃靜置1-2月；c.將上述培養好的發酵液過濾除去菌體；d.將發酵液加熱濃縮至原液體積的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進行色譜分離，以乙酸乙酯/石油醚＝15％清洗后，再用乙酸乙酯/石油醚＝50％為洗脫劑洗脫；e.收集50％的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，濃縮得棕色油狀物即為所需的提取物。
3.權利要求1所述的提取物用于制備抗棉鈴蟲的農藥。
4.權利要求1所述的提取物用于制備抗魚類寄生蟲中華鳋的農藥。
全文摘要
本發明涉及一種南海紅樹林內生真菌的培養物的乙酸乙酯提取物有效部分油狀物及其制備方法和該提取物在制備殺滅棉鈴蟲[Heliothis armigera(Hühner)]和魚類寄生蟲中華鳋(Sinergasilus spp)的農藥中的應用。
文檔編號A01N63/04GK1409967SQ0213496
公開日2003年4月16日 申請日期2002年10月17日 優先權日2002年10月17日
發明者林永成, 陳光英, 佘志剛, 李厚金, 周世寧, 林壁潤, 關利平 申請人:中山大學