利用重組載體在絲狀真菌中篩選外源基因的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種應用重組載體在絲狀真菌中篩選外 源基因的方法。
【背景技術】
[0002] 絲狀真菌是一類由有隔菌絲組成的多細胞微生物，具有較強的蛋白分泌能力，可 以產生豐富的次級代謝產物，因此在酶蛋白、藥物、化工品等的工業生產中有著重要的應用 (Verdoes et al·，1995;Wang et al·，2005)。
[0003]眾多重要的絲狀真菌菌株中，黑曲霉和里氏木霉在科學研究及工業生產中應用最 為廣泛，兩者都是美國食品和藥品管理局認證的GRAS(GenerallyRecognizedasSafe)菌 株，里氏木霉主要作為纖維素酶生產菌而受到重視，其野生型因纖維素的降解能力而被鑒 定，經過多輪的誘變篩選，里氏木霉的胞外蛋白產量可以達到l〇〇g/L以上（Cherryand Fidantsef，2003;Xuetal. ,2009)，濾紙酶活力可以達到33FPU/ml以上，已經成為最主要 的纖維素酶生產菌。
[0004]菌種改造是提升菌株生產性能的關鍵，基于基因工程的遺傳改造是一種有效的菌 種改造的措施(Meyer，2008)。雖然里氏木霉可以生產完整的纖維素降解酶系，但是胞外酶 液中β-葡萄糖苷酶含量較低，Zhang等使用四個拷貝的cbhl啟動子驅動bgll基因在里氏木 霉RutC30中的過表達，將β-葡萄糖苷酶活性提高3.7倍，濾紙酶活提高130 %，酶解玉米芯 產生還原性糖的產量提高29%(Zhangetal.，2010)。
[0005]里氏木霉具有強大的木質纖維素降解能力，因此在聯合生物加工(CBP)過程中有 著重要的潛在應用（Singhetal.，1992;Xuetal.，2009)，CBP的目的是在菌株中構建高 效的由木質纖維素向化學品（如乙醇、脂肪酸等)的一步轉化途徑，目前CBP的研究主要集中 在對酵母的纖維素酶產生能力的改造，這主要是由于酵母乙醇產生能力較強，以及其基因 工程的易操作性;但是纖維素酶系組分較多，有效的組合改造難度較大，因此改造纖維素降 解菌的代謝路徑，實現化學品的生產為我們提供了另一條CBP的思路。
[0006]構建及篩選性狀優良的基因工程菌是一個系統工程，包括基因組水平改造(基于 遺傳轉化的過表達或敲除基因）、改造后工程菌的篩選以及性狀評價等(Moore，2007)。絲狀 真菌的遺傳轉化方法已經相對成熟，包括原生質體轉化、農桿菌介導轉化、電轉化等，將DNA 片段隨機地插入到基因組中。但是由于其形態特點，絲狀真菌的遺傳改造過程相對模式微 生物大腸桿菌、釀酒酵母等更加漫長，絲狀真菌菌落為多核菌絲相互纏繞形成的菌團結構， 不同于常規模式微生物的單一純系菌落，為了在高假陽性背景的轉化平板上獲得純系轉化 子，只能通過繁瑣的單孢分離過程分離單核孢子，造成遺傳改造周期過長;在此基礎上的高 表達量菌株的篩選則更加費時費力。
[0007]代謝通路的構建過程、菌種改造過程中通常需要外源基因的成功表達，但是外源 基因產物會由于生物體嚴謹的控制系統而不能正常形成（CasseltonanddelaFuente Herce, 1989;Ngoepe,2011)，造成人力物力資源及時間的浪費，這種無效消耗在絲狀真菌的 遺傳操作過程中更加嚴重。
[0008] 因此建立一套檢測外源基因表達以及高表達量純系轉化子的快速篩選系統，可以 有效加快絲狀真菌的遺傳改造進程，促進構建絲狀真菌細胞工廠的發展。
【發明內容】
[0009] 本發明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優點。
[0010] 本發明還有一個目的是提供一種在絲狀真菌中成功表達的外源基因的快速篩選 方法，該方法能夠對外源基因是否能夠在絲狀真菌中表達進行快速篩選，比傳統的篩選方 法大大縮短了篩選時間，提高了篩選的工作效率，并且通過后期對轉化子的復篩，獲得高產 量純系轉化子，以適應實際生產的需要。
[0011] 為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了
[0012] -種重組載體，其包括啟動子、外源基因、熒光蛋白和終止子，所述外源基因位于 啟動子的下游，位于終止子或熒光蛋白的上游;所述熒光蛋白位于所述啟動子或外源基因 的下游，位于所述終止子的上游。
[0013] 優選的是，其中，所述外源基因為脂酰輔酶A還原酶基因或與脂酰輔酶A還原酶的 氨基酸序列相似性高于80%的脂酰輔酶A衍生物基因，所述啟動子為翻譯延伸因子1啟動子 和丙酮酸激酶啟動子;所述終止子為內切葡聚糖苷酶I終止子和外切葡聚糖苷酶II終止子。 [0014 ]重組載體在里氏木霉中表達目的蛋白的應用。
[0015]利用重組載體在絲狀真菌中快速篩選外源基因的方法，其特征在于，包括以下步 驟：
[0016] 步驟一、將權利要求1所述的不含外源基因的重組載體轉入絲狀真菌獲得轉化子 I；
[0017] 步驟二、將所述轉化子I培養產孢，應用流式細胞儀分析轉化子孢子I和陰性對照 組獲得分析圖I和分析圖Π，分析圖I中沿橫坐標排布有孢子群I和孢子群Π，根據分布在分 析圖I右側的孢子群Π的分布范圍設定圈定門，在分析圖Π中應用所述圈定門圈定孢子群 ΙΠ；
[0018] 步驟三、構建帶有絲狀真菌啟動子、待測外源基因、熒光蛋白表達基因、和終止子 的絲狀真菌的轉化子Π;以及
[0019] 步驟四、重復步驟二，應用流式細胞儀分析轉化子孢子π獲得分析圖m，應用所述 圈定門在分析圖m中圈定范圍，當落入所述圈定門內的孢子群IV中孢子數量超過孢子群m 中孢子數量時，判定所述待測外源基因成功表達，當落入圈定門內的孢子群iv中孢子數量 低于孢子群m中孢子數量時，判定所述待測外源基因沒有成功表達；
[0020] 其中，所述轉化子孢子I為實驗組，所述陰性對照組為帶有空載體的絲狀真菌孢 子，所述絲狀真菌的轉化子π為待檢測組。
[0021] 優選的是，其中，所述步驟二中圈定門的最小值為分析圖I中沿橫坐標排布的孢子 群I和孢子群Π之間的接觸處所對應的分析圖I中的橫坐標值。
[0022] 優選的是，其中，所述步驟二中應用流式細胞儀分析轉化子孢子I和絲狀真菌孢子 的具體方法為:設置流式細胞儀的樣品壓力為20000EPS，利用前向角散射光面積和寬度圖， 去除粘連和雜信號;熒光信號使用488nm激光激發，FL1通道分析。
[0023]優選的是，其中，所述轉化子的構建方法具體為：
[0024] 7.1)以絲狀真菌的基因組DNA和含熒光蛋白表達基因的質粒為模板PCR擴增獲得 啟動子基因片段、終止子片段和熒光蛋白表達基因片段；
[0025] 7.2)將所述啟動子基因片段、終止子片段和熒光蛋白表達基因片段克隆入載體制 備成質粒;以及
[0026] 7.3)制備絲狀真菌原生質體，應用所述質粒轉化原生質體獲得所述轉化子。
[0027] 優選的是，其中，所述啟動子為翻譯延伸因子1啟動子和丙酮酸激酶啟動子;所述 終止子為內切葡聚糖苷酶I終止子和外切葡聚糖苷酶II終止子。
[0028]優選的是，其中，所述步驟7.2)還包括:在重組酶的作用下，將PCR擴增得到的啟動 子、終止子片段和熒光蛋白表達基因片段組裝成Ppki-gfp-TCbh2、Ppki-hph-Tcbh2或 Ptefl-gfp-Tegll的結構克隆到pS頂PLE-19EcoRVBAP載體上；以及將外源待測基因整合 至上述載體gfp的上游位置。
[0029] 優選的是，其中，將分析圖m中落入所述圈定門內的孢子群iv中孢子以單孔單孢 的形式，分