專利名稱：利用微生物防治白蟻的方法
技術領域：
本發明涉及利用微生物防治白蟻的方法，尤其是利用人工培養的病原細菌Xenorhabdusnematophilus或Photorhabdus luminescens與人工培養的病原真菌球孢白僵菌Beauveriabassiana組合，防治家白蟻(Coptotermes formosanus)的方法。
背景技術：
家白蟻是危害性很強的社會性昆蟲。目前，控制白蟻的常用方法有兩類一是白蟻預防；二是白蟻防治。白蟻預防是利用化學藥劑處理土壤或木結構，以趨避和防止白蟻危害；或利用物理障礙物或藥劑障礙帶，使白蟻不能入侵各類建筑物和目標危害物。白蟻防治是使用各種化學藥劑處理被白蟻危害的位置；或者設置誘導箱誘導白蟻，然后使用各種化學藥劑施用于誘導箱中，被藥劑感染的白蟻可重復感染與其接觸的其它白蟻。為了維持白蟻的預防和防治效果，通常使用高毒性和高殘留的化學藥劑，如毒死蜱、氯丹及擬除蟲菊，砒霜(三氧化二砷)和滅蟻靈(有機氯殺蟲劑)等。
許多專利涉及到使用化學藥劑或物理障礙物預防和防治白蟻的方法(US Patent No.6397516)。使用高毒性和高殘留的化學藥劑帶來的眾所周知的副作用是污染環境以及威脅人畜安全。因此，對環境友好以及對人畜安全的生物制劑已被用于白蟻防治。
白蟻的自然天敵包括捕食性的鳥類、蜘蛛，蜥蜴，蜈蚣，螞蟻寄生性的寄生螨、寄生蠅、寄生性線蟲等。幾種病原微生物已發現可感染白蟻。Sugiura et al(US Patent No.5728573，1998)利用一種病原真菌Beauveria brongniartii防治白蟻。Metarhizium屬和Beauveria屬病原真菌也用于防治白蟻(US Patent No.5141744；US Patent No.5512280；US Patent No.5595746；US Patent Application No.20010006632)。Beauveria屬的球孢白僵菌從寄主昆蟲的表皮侵入昆蟲體內，并在昆蟲體內發育，導致昆蟲死亡。侵染昆蟲時，首先是病原真菌的分生孢子附著在昆蟲體表，孢子萌發后產生入侵菌絲，最后導致寄主死亡。
Xenorhabdus和Photorhabdus屬共生細菌分別分離于昆蟲病原斯氏屬Steinernema與異小桿屬Heterorhabditis線蟲。這兩個屬的昆蟲病原線蟲是新型生物殺蟲劑。這類線蟲之所以致死昆蟲是由于Xenorhabdus和Photorhabdus屬共生細菌的作用。線蟲以感染期蟲態(infectivejuveniles，IJ)隨寄主食物或從昆蟲的自然開口(如肛門、氣孔)、節間膜進入昆蟲體內，隨后釋放腸腔中攜帶的Xenorhabdus和Photorhabdus屬共生細菌。共生細菌分泌的毒素(毒性因子)導致昆蟲死亡。原先，科學家們認為，Xenorhabdus屬和Photorhabdus屬的共生細菌只有被線蟲攜帶或注射進入昆蟲體內時才發揮殺蟲作用(Akhurst.Journal of GeneralMicrobiology，1980，121303-309；Bedding.Annals of Applied Biology，1984，104117-120；Forst & Nealson.Microbiological Review，1996，6021-43)。最近發現，共生細菌可通過口服單獨致死昆蟲(李素春等.第六屆全國殺蟲微生物學術討論會論文摘要集.1995.43；Dudney R.US Patent No.488820，1997；Jarrett et al.PCT Patent No.98/08388，1998；Ragni etal.PCT Patent No.98/05212，1998)，從共生菌中可分離出蛋白質毒素(Ensign et al.PCT PatentNo.97/17432，1997；Bowen et al.Science，1998，2802129-2132；Ensign et al.US Patent No.072264，2000)。這類細菌已用于防治火蟻(US Patent No.5616318)和白蟻(US PatentApplication No.20030082147)。
盡管Xenorhabdus和Photorhabdus屬細菌，以及球孢白僵菌Beauveria bassiana病原真菌已經被應用于防治白蟻，但是一起施用這兩類生物制劑防治白蟻的工作未見報道。
發明內容
本發明的目的在于開發一種微生物的防治白蟻的方法。
本發明作者發現，Xenorhabdus nematophilus或Photorhabdus luminescens病原細菌與球孢白僵菌Beauveria bassiana病原真菌協同使用對家白蟻防治具有增效作用，從而開發出一種有效的微生物防治白蟻的方法，實現了本發明的目的。
本發明利用微生物防治白蟻的方法，其特征在于使家白蟻染上Xenorhabdus nematophilus或Photorhabdus luminescens病原細菌與球孢白僵菌Beauveria bassiana病原真菌。
本發明可以通過將含有所述病原細菌的制劑和含有所述病原真菌的制劑分別施用于同一白蟻群或施用于同一白蟻誘導箱中，使家白蟻先后直接或間接染上所述病原細菌和所述的病原真菌；也可以通過將含有所述病原細菌的制劑和含有所述病原真菌的制劑混合后施用于白蟻群或施用于白蟻誘導箱中，使家白蟻同時染上所述病原細菌和所述的病原真菌。所述制劑的施用采用常規的方法，例如以常規噴霧器或其它施用工具(如注射、灌溉等)應用于白蟻巢或白蟻活動的場所或白蟻誘導箱中。
本發明所述Xenorhabdus nematophilus和Photorhabdus luminescens細菌分別歸屬Xenorhabdus和Photorhabdus屬，分別分離自斯氏科Steinemematidae斯氏屬Steinernema與異小桿科Heterorhabditidae異小桿屬Heterorhabditis昆蟲病原感染期線蟲，目前在分類上歸屬于Enterobacteriaceae科。
本發明所述的Xenorhabdus nematophilus和Photorhabdus luminescens細菌的人工培養采用常規的、已有的技術，分離、純化后，以人工培養基(如蛋白胨水培養基或其它能夠培養這類細菌的培養基)體外培養，包括以發酵罐或反應器系統培養后，所獲得的菌液可直接或經分離、提取和提純得到的有效組分用作本發明所用制劑的組分，在本發明中施用。
本發明所述的球孢白僵菌Beauveria bassiana病原真菌的人工培養采用常規的、已有的技術，以人工培養基(如常用的馬鈴薯葡萄糖培養基或其它能夠培養這類真菌的培養基)體外培養，包括以發酵罐或反應器系統培養后，所獲得的孢子可用作本發明所用制劑的組分，在本發明中施用。
本發明所述制劑可以是適用于生物制劑的一切劑型，如液劑、可濕性粉劑等，也可加入輔助劑，如吸附劑、濕潤劑、防腐劑、粘著劑、引誘劑、保護劑和增效劑等配置成不同的劑型。
所述制劑中所述的病原細菌和病原真菌的含量沒有特別的要求，與通常的生物制劑一樣，為了得到好的效果，其含量要足夠，根據蟻的發生情況和數量，液劑中所述的病原細菌一般為每毫升105～108數量級菌體范圍，最佳為每毫升107～108數量級菌體，所述的病原真菌一般為每毫升105～109數量級孢子的范圍，最佳為每毫升107～109數量級孢子；粉劑中所述的病原細菌一般為每克105～109數量級菌體的范圍，最佳為每克107～109數量級菌體，所述的病原真菌一般為每克105～109數量級孢子的范圍，最佳為每克107～109數量級孢子。
本發明所述制劑以常規噴霧器或其它施用工具(如注射、灌溉等)應用于白蟻巢或白蟻活動的場所或白蟻誘導箱中。
所述的白蟻誘導箱采用常規的和已有的技術設置，由白蟻喜愛的木材(如杉木)或纖維素類物質組成，也可加入白蟻誘導劑(如蔗糖等糖類溶液、與白蟻共生真菌的分泌物等)。誘導箱一般放置于白蟻巢附近或白蟻活動場所，引誘白蟻取食誘導箱的木材或纖維素類物質，或引誘白蟻在誘導箱中活動。白蟻接觸到生物制劑后，受到感染，被感染的白蟻又可交叉感染其它白蟻個體，引起整巢白蟻的感染，從而達到防治白蟻的目的。
本發明由于協同使用了所述的病原細菌和所述的病原真菌，對白蟻的殺滅效果明顯優于單獨使用所述細菌和真菌的時候，詳見實施例。
具體實施例方式
下列實驗及操作實例是進一步對本發明的說明，不應該當作對本發明的限制。
實例一Xenorhabdus和Photorhabdus屬細菌，以及球孢白僵菌Beauveria bassiana的培養和劑型配制，用于實施例2～7。
Xenorhabdus和Photorhabdus屬細菌的培養和劑型配制。
于500mL三角瓶中加入100mL液體培養基(1％蛋白胨，0.5％NaCl)，121℃下高壓消毒30分鐘。然后接入1mL X.nematophilus或P.luminescens初生型共生菌菌種，置于25℃、150r/min下搖床培養48小時，所獲得菌液(約每毫升107～108菌體)可作為水劑，施用于防治白蟻。這類細菌也可以發酵罐或反應器大量培養。使用細菌菌液時，本專業領域的人員可根據白蟻的發生情況和數量，將菌液稀釋成每毫升105～108菌體范圍，然后施用于防治白蟻。但是，最佳的菌液濃度為每毫升107～108菌體。
所培養的菌液經過離心機離心后，收獲細菌體，然后加入填充劑(如木屑、玉米粉、硅藻土等)，可配制成粉劑。使用細菌粉劑時，本專業領域的人員可根據白蟻的發生情況和數量，將粉劑制成每克105～109菌體的范圍，然后施用于防治白蟻。但是，最佳的粉劑濃度為每克107～109菌體。
球孢白僵菌的培養和劑型配制球孢白僵菌以馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)或蒸熟的大米作為培養基于25℃培養室中培養7～10天后，培養平板或培養盒中長滿菌絲并產生孢子。所長的孢子和菌絲可用水洗下，制成液劑，直接施用于白蟻。使用球孢白僵菌菌液時，本專業領域的人員可根據白蟻的發生情況和數量，將菌液稀釋成每毫升105～109孢子的范圍，然后施用于防治白蟻。但是，最佳的孢子濃度為每毫升107～109孢子。
如加入填充劑(如硅藻土、玉米粉等)后，可制成粉劑再施用于防治白蟻。使用球孢白僵菌粉劑時，本專業領域的人員可根據白蟻的發生情況和數量，將粉劑制成每克105～109孢子的范圍，然后施用于防治白蟻。但是，最佳的粉劑濃度為每克107～109孢子。
實例2混合使用病原細菌菌液以及病原真菌孢子液防治家白蟻。
X.nematophilus細菌或P.luminescens細菌于液體培養基(1％蛋白胨，0.5％NaCl)中培養后，得到菌液(約每毫升5×108菌體)。球孢白僵菌以馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)于25℃培養室中培養10天后，平板上長滿菌絲并產生孢子。平板中所長的孢子用無菌水洗下，制成液劑(約每毫升5×107孢子)。于每個高壓消毒的平板(直徑＝9cm)中加入一層中速濾紙和1克含水量為10％的木屑(也經高壓消毒)，取0.5毫升細菌菌液和0.5毫升真菌孢子液混勻，然后加入木屑中。再于平板中加入20頭未被細菌和真菌感染的的工蟻。于平板中僅加入細菌菌液，或僅加入真菌孢子液，或未接觸生物制劑的白蟻置于同樣的培養皿中作為對照。每個處理設4個平板的重復。將所有的平板以封口膜封口，置于25℃下。每天檢查白蟻的死亡情況，記錄白蟻死亡數。
測定后第五天，各菌株及菌株組合對家白蟻的防治效果見表1。從表1可以看出，混合使用細菌和真菌孢子液對家白蟻的防治效果大于單獨使用細菌菌液或真菌孢子液。
表1混合使用病原細菌菌液以及病原真菌孢子液防治家白蟻的防治效果
實例3混合使用病原細菌以及病原真菌粉劑防治家白蟻。
于每個高壓消毒的平板(直徑＝9cm)中加入一層中速濾紙和1克含水量為10％的木屑(也經高壓消毒)，根據實例一所述配制的粉劑，取0.5克細菌粉劑(約含每克108菌體)和0.5克真菌孢子粉劑(約含每克108孢子)混勻，然后加入木屑中。再于平板中加入20頭未被細菌和真菌感染的的工蟻。于平板中僅加入細菌粉劑，或僅加入球孢白僵菌孢子粉劑，或未接觸生物制劑的白蟻置于同樣的培養皿中作為對照。每個處理設4個平板的重復。將所有的平板以封口膜封口，置于25℃下。每天檢查白蟻的死亡情況，記錄白蟻死亡數。
測定后第五天，各菌株及菌株組合對家白蟻的防治效果見表2。從表2可以看出，混合使用細菌和真菌孢子粉劑對家白蟻的防治效果大于單獨使用細菌粉劑或真菌孢子粉劑的防治效果。
表2混合使用病原細菌粉劑以及病原真菌孢子粉劑防治家白蟻的防治效果
實例4分別施用病原細菌菌液以及病原真菌粉劑使家白蟻先后直接染上細菌和真菌。
于每個高壓消毒的平板(直徑＝9cm)中加入一層中速濾紙和1克含水量為50％的木屑(也經高壓消毒)，然后于木屑中混入0.5毫升X.nematophilus或P.luminescens細菌菌液(約每毫升5×108菌體)。再于平板中加入20頭已經在涂有真菌粉劑(約每克109孢子)的平板中爬動一分鐘的工蟻。在真菌平板中爬動一分鐘的工蟻身上帶有真菌孢子。于平板中僅加入0.5毫升X.nematophilus或P.luminescens細菌菌液，或僅加入20頭已經在長有真菌的平板中爬動一分鐘的工蟻，或未接觸真菌孢子的白蟻置于同樣的培養皿中作為對照。每個處理設4個平板的重復。將所有的培養皿以封口膜封口，置于25℃下。每天檢查白蟻的死亡情況，記錄白蟻死亡數。
測定后第五天，各菌株及菌株組合對家白蟻的防治效果見表3。從表3可以看出，單獨使用各種菌株對家白蟻的防治效果不如組合使用細菌菌株和真菌菌株的防治效果。家白蟻取食混有X.nematophilus或P.luminescens細菌菌液后，這些細菌產生的毒性物質對家白蟻有致死作用，或者破壞家白蟻的免疫系統使真菌易于發揮作用。
表3分別施用病原細菌菌液以及病原真菌粉劑使家白蟻先后直接染上細菌和真菌的防治效果
實例5分別施用病原細菌菌液以及病原真菌孢子液使家白蟻擴散(間接)染上細菌和真菌。
于每個高壓消毒的平板(直徑＝9cm)中加入一層中速濾紙和1克含水量為50％的木屑(也經高壓消毒)，然后于木屑中混入0.5毫升X.nematophilus或P.luminescens細菌菌液(約每毫升107菌體)。再于平板中加入19頭工蟻，和1頭已經在涂有真菌液(約每毫升109孢子)的平板中爬動一分鐘的工蟻。在真菌平板中爬動一分鐘的工蟻身上帶有真菌孢子。通過接觸，帶有真菌孢子的白蟻可將孢子傳染給其它健康白蟻個體，引起交叉感染。于平板中僅加入0.5毫升X.nematophilus或P.luminescens細菌菌液，或僅加入1頭已經在長有真菌的平板中爬動一分鐘的工蟻，或未接觸真菌孢子的白蟻置于同樣的培養皿中作為對照。每個處理設4個平板的重復。將所有的培養皿以封口膜封口，置于25℃下。每天檢查白蟻的死亡情況，記錄白蟻死亡數。
測定后第五天，各菌株及菌株組合對家白蟻的防治效果見表4。從表4可以看出，1頭帶有真菌孢子的家白蟻需要時間去交叉感染平板中的其它白蟻個體，但是，測定后第五天的檢查結果也表明，單獨使用各種菌株對家白蟻的防治效果不如組合使用細菌菌株和真菌菌株的防治效果。
表4分別施用病原細菌菌液以及病原真菌孢子液使家白蟻擴散染上細菌和真菌的防治效果
實例6分別使用病原細菌粉劑以及病原真菌粉劑使家白蟻先后直接染上細菌和真菌。
于每個高壓消毒的平板(直徑＝9cm)中加入一層中速濾紙和1克含水量為50％的木屑(也經高壓消毒)，根據實例一所述配制的粉劑，取0.5克X.nematophilus或P.luminescens細菌菌液(約含每克107菌體)。再于平板中加入20頭已經在涂有真菌粉劑(約每克107孢子)的平板中爬動一分鐘的工蟻，在真菌平板中爬動一分鐘的工蟻身上帶有真菌孢子。于平板中僅加入0.5克X.nematophilus或P.luminescens細菌菌液，或僅加入20頭已經在長有真菌的平板中爬動一分鐘的工蟻，或未接觸真菌孢子的白蟻置于同樣的培養皿中作為對照。每個處理設4個平板的重復。將所有的培養皿以封口膜封口，置于25℃下。每天檢查白蟻的死亡情況，記錄白蟻死亡數。
測定后第五天，各菌株及菌株組合對家白蟻的防治效果見表5。從表5可以看出，單獨使用各種菌株對家白蟻的防治效果不如組合使用細菌菌株和真菌菌株的防治效果。家白蟻取食混有X.nematophilus或P.luminescens細菌菌液后，這些細菌產生的毒性物質對家白蟻有致死作用，或者破壞家白蟻的免疫系統使真菌易于發揮作用。
表5分別施用病原細菌粉劑以及病原真菌粉劑使家白蟻先后直接染上細菌和真菌的防治效果
實例7分別施用病原細菌粉劑以及病原真菌液劑使家白蟻擴散(間接)染上細菌和真菌。
于每個高壓消毒的平板(直徑＝9cm)中加入一層中速濾紙和1克含水量為50％的木屑(也經高壓消毒)，然后于木屑中混入0.5克X.nematophilus或P.luminescens細菌粉劑(約每克109菌體)。再于平板中加入19頭工蟻，和1頭已經在涂有真菌液(約每毫升109孢子)的平板中爬動一分鐘的工蟻。在真菌平板中爬動一分鐘的工蟻身上帶有真菌孢子。通過接觸，帶有真菌孢子的白蟻可將孢子傳染給其它健康白蟻個體，引起交叉感染。于平板中僅加入0.5克X.nematophilus或P.luminescens細菌粉劑，或僅加入1頭已經在長有真菌的平板中爬動一分鐘的工蟻，或未接觸真菌孢子的白蟻置于同樣的培養皿中作為對照。每個處理設4個平板的重復。將所有的培養皿以封口膜封口，置于25℃下。每天檢查白蟻的死亡情況，記錄白蟻死亡數。
測定后第五天，各菌株及菌株組合對家白蟻的防治效果見表6。從表6可以看出，1頭帶有真菌孢子的家白蟻需要時間去交叉感染平板中的其它白蟻個體，但是，測定后第五天的檢查結果也表明，單獨使用各種菌株對家白蟻的防治效果不如組合使用細菌菌株和真菌菌株的防治效果。
表6分別施用病原細菌菌液以及病原真菌孢子液使家白蟻擴散染上細菌和真菌的防治效果
權利要求
1.一種利用微生物防治白蟻的方法，其特征在于使家白蟻染上Xenorhabdus nematophilus或Photorhabdus luminescens病原細菌與球孢白僵菌Beauveria bassiana病原真菌。
2.根據權利要求1所述的利用微生物防治白蟻的方法，其特征在于通過將含有所述病原細菌的制劑和含有所述病原真菌的制劑分別施用于同一白蟻群或施用于同一白蟻誘導箱中，使家白蟻先后直接或簡接染上所述病原細菌和所述的病原真菌。
3.根據權利要求1所述的利用微生物防治白蟻的方法，其特征在于通過將含有所述病原細菌的制劑和含有所述病原真菌的制劑混合后施用于白蟻群或施用于白蟻誘導箱中，使家白蟻同時染上所述病原細菌和所述的病原真菌。
4.根據權利要求2或3所述的利用微生物防治白蟻的方法，其特征在于所述的制劑為液劑或粉劑；所述的液劑中含有所述的病原細菌107～108數量級菌體/毫升，含有所述的病原真菌107～109數量級孢子/毫升；所述的粉劑中含有所述的病原細菌107～109數量級菌體/克，含有所述的病原真菌107～109數量級孢子/克。
全文摘要
本發明涉及一種利用微生物防治白蟻的方法。其特征在于使家白蟻染上Xenorhabdus nematophilus或Photorhabdus luminescens病原細菌與球孢白僵菌Beauveria bassiana病原真菌。將含有所述病原細菌的制劑和含有所述病原真菌的制劑分別或混合后直接施用于白蟻群(白蟻巢或白蟻活動的場所)或施用于同一白蟻誘導物(如纖維素類物質)上，使家白蟻先后或同時染上所述病原細菌和所述的病原真菌。由于所述病原細菌和所述病原真菌的協同效應，對家白蟻的殺滅有明顯的增效作用。本發明是防治白蟻的有效方法。
文檔編號A01N63/04GK1623398SQ20031011243
公開日2005年6月8日 申請日期2003年12月4日 優先權日2003年12月4日
發明者韓日疇, 曹莉, 劉秀玲, 陳鏡華, 何向陽 申請人:廣東省昆蟲研究所