專利名稱：圓斑星鰈增精及精子冷凍保存方法
技術領域：
本發明涉及魚類增加精量及精子的冷凍保存，具體地說是海洋魚類圓斑星鰈增加精子量及精子冷凍保存方法，對雄性圓斑星鰈通過注射激素，把精子降溫。液氮保存及解凍，獲取具有受精能力精子的過程。
背景技術：
圓斑星鰈分布于我國北部的黃渤海、日本中部以南和韓國西南部的沿海海域。圓斑星鰈體形較大，生長速度較快，骨刺少、內臟團小，可食部分多，是優良養殖品種。由于圓斑星鰈自然資源匱乏，捕獲量沒形成規模，而且是本土自然種類，資源可持續利用發展，其養殖前景廣闊。目前我國已有部分單位進行圓斑星鰈的養殖及人工繁殖嘗試。
圓斑星鰈在室內培育，雌、雄親魚性成熟不同步；圓斑星鰈不易在室內自然產卵，而且在人工飼育下排卵周期不穩定，卵巢腔內常常過熟，受精率顯著下降；雄性圓斑星鰈精量少，一般自然成熟的精量0.7ml左右，很難采集，達不到人工繁殖生產時所需的精液量。由于上述幾個原因，嚴重制約著圓斑星鰈人工繁殖技術的提高。采用激素處理方法，使雄性圓斑星鰈增加精液量；冷凍保存圓斑星鰈精子，保證其質量，具備受精能力，才能確保圓斑星鰈人工繁殖順利進行。
發明內容
本發明的目的在于提供一種增加海洋魚類圓斑星鰈人工繁殖精液量及精子冷凍保存方法。
為實現上述目的，本發明采取的技術方案為選擇雄性成熟圓斑星鰈，對其進行激素誘導；采精后，添加抗凍液在0～4℃預冷9-11分鐘，分段降溫至-180℃后投入液氮中保存。
所述雄性成熟圓斑星鰈是能擠出乳白色精液的雄魚，對其進行激素誘導增加精量。誘導激素為絨毛膜促性腺激素(HCG)，將HCG以150IU/kg注射到腹腔，每間隔2天注射一次，連續注射三次，7天后采精。抗凍液是以平衡鹽溶液Hank’s為基液，其中含有體積含量10％(V/V)的二甲基亞砜(DMSO)和體積含量5％(V/V)的甘油(Gly)二種抗凍劑；分段降溫是指0～-80℃降溫速度為20℃/分鐘，-80℃時平衡2分鐘，-80～-180℃降溫速度為20℃/分鐘。精液與抗凍液的體積比為1∶2。
所述保存后的圓斑星鰈精液解凍時，放入43℃水溫解凍至微融化后室溫解凍。
本發明具有如下優點1、誘導性成熟雄性圓斑星鰈增加精量，時間短，誘導效果好，便于生產實踐中操作。
2、以150IU/kg的HCG進行三次誘導，對圓斑星鰈損傷程度小，促進其性腺正常發育。
3、DMSO和Gly二種抗凍劑混合使用，減輕毒性作用。
4、以20℃/分鐘速度快速降溫，使冷凍精子安全快速度過“危險溫度區”，降低胞內冰晶的冷凍損傷。
5、冷凍精子從液氮中取出后，直接放入43℃中水溫解凍，快速度過重結晶區，減少重結晶對精子的損傷。
本發明的圓斑星鰈增精及冷凍保存對于圓斑星鰈這種海水名貴魚類的育種、種質保存、遺傳多樣性及可持續養殖等方面有著重要意義。
具體實施例方式
實施例(1)挑選體重1kg能擠出乳白色精液的雄魚進行激素誘導，水溫是12℃，光照每天14小時，腹腔注射HCG150IU/kg，每隔二天注射一次，連續三次，7天后獲取6ml精液。
(2)按精液與抗凍液體積比1∶2，將精液放入體積含量為DMSO10％+Gly5％以平衡鹽溶液Hank’s為基液的抗凍液中，在0～4℃冰箱中平衡10分鐘，從冰箱中取3個2ml的凍存管，各吸取2ml抗凍液，快速放入程序降溫儀，開始降溫。
(3)降溫程序為0～-80℃，降溫速度為20℃/min；-80℃平衡2分鐘；-80～-180℃，降溫速度為20℃/min；降至-180℃時，迅速將凍存管投入液氮罐中保存。
(4)保存4個月后取出凍存管，迅速放入43℃水溫鍋中解凍，微融化后室溫解凍。
(5)解凍后，用海水激活進行鏡檢，精子復活率大于90％。
(6)用精子動(靜)態圖像分析系統(CASA)分析凍精活力情況，檢測分析結果凍精活動率為92.38％，其中快速向前運動的占50.00％，凍精平均曲線運動速度(VCL)為63.68(微米/秒)，平均直線運動速度(VSL)為42.45(微米/秒)，平均路徑速度(VAP)為46.69(微米/秒)。
權利要求
1.圓斑星鰈增精及精子冷凍保存方法，其特征在于選擇能擠出乳白色精液的雄性圓斑星鰈，對其進行激素誘導，增加精量；獲取精液后，添加抗凍液在0～4℃預冷9～11分鐘，分段降溫至-180℃投入液氮中保存。
2.按照權利要求1所述圓斑星鰈增精及精子冷凍保存方法，其特征在于所述激素誘導，是將HCG以150IU/kg注射到雄魚腹腔，每個二天注射一次，連續三次。
3.按照權利要求1所述圓斑星鰈增精及精子冷凍保存方法，其特征在于所述抗凍液是以平衡鹽溶液Hank’s為基液，其中含有體積含量10％的二甲基亞砜和體積含量5％的甘油二種抗凍劑。
4.按照權利要求1所述圓斑星鰈增精及精子冷凍保存方法，其特征在于所述分段降溫是指0～-80℃，降溫速度為20℃/min；-80℃時平衡2分鐘；-80～180℃，降溫速度為20℃/min。
5.按照權利要求1所述圓斑星鰈增精及精子冷凍保存方法，其特征在于所述保存的圓斑星鰈精子解凍時，直接放入43℃水溫解凍至微融化后室溫解凍，獲取具有受精能力的精子。
全文摘要
本發明涉及魚類增加精量及精子冷凍保存，具體地說是海洋魚類圓斑星鰈增加精子量及精子冷凍保存方法。選擇能擠出乳白色精液的雄性圓斑星鰈，對其用HCG以150IU/kg腹腔注射進行誘導增精；獲取精液后，添加抗凍液在0～4℃預冷9～11分鐘，分段降溫至－180℃投入液氮中保存；解凍時，直接放入43℃水溫至微融化后室溫解凍，獲取具有受精能力的精子。本發明的圓斑星鰈增精及精子冷凍保存對于圓斑星鰈這種海水名貴魚類的育種、種質保存、遺傳多樣性及可持續養殖等方面有著重要意義。
文檔編號A01N1/00GK1748709SQ20041005041
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月15日 優先權日2004年9月15日
發明者肖志忠, 丁福紅, 李軍 申請人:中國科學院海洋研究所