專利名稱：條斑星鰈精子冷凍保存方法
技術領域：
本發明屬于低溫生物學精子冷凍保存技術，是一種在超低溫環境中長期冷凍保存 條斑星鰈精子的簡單實用方法。
背景技術：
低溫生物學是研究低溫對生物所產生的影響及低溫在與生物有關的各個領域中 應用的科學，幾乎所有在低于正常生物適于生存的溫度下進行的與生物有關的實驗研究或 理論探索都屬于低溫生物學的范疇。在種質資源保護方面，用低溫保存動物的精子和胚胎， 不僅可以在生產實踐中實現巨大的經濟效益，還可以把優良品種的精子和胚胎長期保存起 來，以防傳染病等自然災害造成優良品種滅絕。目前，人們正在利用低溫冷凍保存的方法， 建立各種生物的遺傳種質庫以用于各種生物的遺傳學研究和生物多樣性保護。自1953年Blaxter首次報道冷凍保存大西洋鯡的精子以來，學者們已經對200多 種魚類精子的冷凍保存技術進行了研究(美國，Oxford出版社，Billard et al.，1995)。在 魚類精子冷凍保存中，所使用最頻繁的是保護劑為二甲亞砜(Me2S0)，占所有報道的98%， 其次是甘油(GLY) (50%)、乙二醇(EG) (29%)、甲醇(MeOH) (16% )、1，2-丙二醇(PG) (5%) 及二甲基乙酰胺占3%，但是蛋黃作為保護劑卻較為少見，如張永忠等(2006)報道使用二 甲亞砜和蛋黃組合獲得了較好的牙鲆精子冷凍保存效果，使用蛋黃的優點在于獲取方便， 精子保護效果明顯，精子經冷凍解凍后受精率高(中國海洋大學博士學位論文，青島，中 國)。人工養殖和溫光調控條件下，條斑星鰈雄性親魚常常會表現出批次精液間質量的巨大 差異，多數時候表現出粘稠度過高、精子活動率低(30%-40%)、精子壽命短(l-6min)等癥 狀，嚴重影響了卵子受精率和批量受精卵的獲取，阻礙了人工繁育技術的發展，因此在獲取 了質量較高的精液后，用冷凍保存的方法將高質量的精液保存下來，待獲取高質量卵子后 進行人工受精，可顯著提高人工繁殖成功的幾率，保證獲取優質受精卵和苗種培育的順利 進行。
發明內容
本發明的目的提供一種簡單、實用的條斑星鰈精子冷凍保存方法，以期為企業規 模化苗種繁育提供可長期或短期精液保存的技術，同時為條斑星鰈遺傳育種、生物多樣性 保護和雌核發育技術提供技術支持。本發明按以下技術方案實現本方法內容包括1、精液采集；2、基礎液和抗凍保護劑的配制；3、精子的稀釋與 平衡；4、精子冷凍；5、精子復蘇及受精效果檢驗。1、精液采集選擇性腺發育成熟的雄性親魚，利用150mg/L的MS222麻醉后，采 用腹部擠壓法獲取精液，以吸管和干燥的1. 5ml離心管收集精液。采集精液時先用干凈的 毛巾或者吸水紙擦拭干凈生殖孔周圍粘液和水分，確保采集的精液無尿液和體表粘液的污 染。精液采集后置于冰上保存，活動率85%以上的精液樣品用于精子冷凍。
2、基礎液和抗凍保護劑的配制基礎液選用Hank— s液作為基礎液，配方為CaCl2 2H20 0. 185g/L，無水 MgS040 . 09 7 6 7g/L, KC1 0. 4g/L, Na2HP04 0 . 06g/L, NaCl 8g/L, NaH2P040 . 04 7 88g/L, D_ 葡萄 糖 lg/L，NaHC030 . 35g/L,以 IN HCL 調節 pH 至 7. 6。抗凍保護劑以15% DMS0(以基礎液的體積百分比)+10%蛋黃作為抗凍保護劑 (以基礎液的體積百分比)。3、精子的稀釋與平衡將精液與預冷的(4°C )基礎液按照體積比1 2混合， 然后按照要求(15%DMS0+10%蛋黃)的體積比加入抗凍保護劑，在冰上或4°C冰箱平衡 4-6min。4、精子冷凍將平衡后的精液和稀釋液混合液按照每管1. 8ml分裝入2ml凍存管 中，按照三步降溫法進行冷凍保存。即液氮罐頸部(約_15°C )停留2min ；液氮面上約4cm 處(約-160°C )停留5min ；再直接投入液氮中保存。5、精子復蘇受精效果檢驗精子復蘇解凍時，先將凍存管提至罐口，在液氮蒸汽中停留約3min，然后將冷凍 管取出迅速置于28°C水浴中解凍60s至精液微融化，取出置于室溫下至完全融化。在室溫 條件下，以自然海水激活精子，檢查精子活力。凍精復蘇后的受精效果檢驗人工采集成熟條斑星鰈卵子，以新鮮精液和解凍后 復蘇精液分別進行人工授精。將受精卵置于循環流水孵化系統進行孵化，統計受精率和孵化率。本發明與已有技術對比其特點1、采用DMS0和蛋黃兩種抗凍保護劑混合冷凍精液，毒性作用小，且使用蛋黃，成 本低、來源廣泛、取材方便。2、采用三步降溫法，可快速度過冷凍損傷易發區，操作簡單。3、精液保存解凍后活動率高、受精效果好，平均受精率可達到70%以上，孵化率達 到50%以上，與新鮮精液的受精效果和孵化效果基本相同。4、本發明的精子冷凍保存技術易于掌握，對于從事條斑星鰈苗種繁育的企業具有 重要的實用價值，冷凍精液可在實際生產中大規模應用。同時對于條斑星鰈的種質保存、遺 傳育種和養殖業的可持續發展具有重要意義。
具體實施例方式下面通過具體實施例敘述本發明的技術內容本研究在青島忠海水產有限公司進行，研究內容包括1、精液采集；2、基礎液和 抗凍劑的配制；3、精子的稀釋與平衡；4、精子冷凍；5、精子復蘇及凍精復蘇后的受精效果 檢驗。具體實旋過程如下1、精液采集在繁殖季節挑選達到性成熟的雄性條斑星鰈親魚，利用150mg/L的 MS222麻醉后，采用腹部擠壓法獲取精液，用手輕輕擠壓腹部，可擠出乳白色精液，以吸管和 干燥的1. 5ml離心管收集精液。采集精液時先用干凈的毛巾或者吸水紙擦拭干凈生殖孔周 圍粘液和水分，精液采集過程中嚴禁尿液和體表粘液的污染。精液采集后置于冰上備用，鏡 檢達到85%以上的樣品用于冷凍保存。
2、基礎液和抗凍保護劑的配制基礎液選用Hank— s液作為基礎液，配方為CaCl2 2H20 0. 185g/L，無水 MgS040 . 09 7 6 7g/L, KC1 0. 4g/L, Na2HP040 . 06g/L, NaCl 8g/L, NaH2P040 . 04 7 88g/L, D_ 葡萄糖 lg/L, NaHC030. 35g/L,以 IN HCL 調節 pH 至 7. 6，備用。抗凍保護劑以15% DMS0(以基礎液的百分比)+10%蛋黃作為抗凍保護劑(以基 礎液的百分比)。3、精子的稀釋與平衡精液與預冷的(4°C )基礎液按照體積比1 2進行混合， 然后調節加入15%的DMS0(基礎液的百分比)和10%的蛋黃，混合均勻后，置于冰上或者 4°C冰箱平衡5min。4、精子冷凍將平衡后的精液和稀釋液混合液按照每管1. 8ml分裝入2ml凍存管 中，按照三步降溫法進行冷凍保存。即液氮罐頸部(約_15°C )停留2min，液氮面上約4cm 處(約-160°C )停留5min，再直接投入液氮中保存。5、精子復蘇受精效果檢驗精子復蘇每20天抽取一管精液進行復蘇檢查精子活力，凍精活力基本與冷凍前 鮮精一致。冷凍2-3個月后，取出數管冷凍精液解凍，在液氮罐口部蒸汽中停留3mi n后快 速投入28°C水浴解凍60s至精液微融化，(管中凍精外層開始融化)，取出置于室溫下完全 融化。在室溫條件下，取lPl解凍精液加50 yl自然海水激活精子，檢查精子活力，精子活 力為 75. 8% 士4. 6。凍精復蘇后的受精效果檢驗人工采集成熟條斑星鰈卵子，使用解凍后的精液與 新鮮精液分別與剛采集的圓斑星鰈卵子進行人工受精，將受精卵置于循環流水孵化系統進 行孵化，統計受精率和孵化率。其方法是將解凍后的精液用海水激活后即刻對卵子授精， 授精時間lOmin，用新鮮海水沖洗卵子并將沉卵和漂浮卵分離，將各組處理中的浮卵分別計 數500粒，分別移入容積為10000ml的玻璃缸內，用控溫儀控溫11_12°C孵化，鹽度30，連續 微量充氣流水孵化，3h后檢查受精率，受精率為72.7% 士3.9 ;249h后胚胎孵化出膜，統計 孵化率為52. 6% 士4. 5。經過3次大規模(卵子量在500ml以上)受精檢驗，發現平均受精率均可達到70% 以上，孵化率達到50%以上，與新鮮精液的受精效果和孵化效果基本相同，表明該種精子冷 凍保存方法效果良好，可用于大規模苗種生產。
權利要求
一種條斑星鰈精子冷凍保存方法，其特征在于它的方法內容包括(1)、精液采集，(2)、基礎液選擇，(3)、抗凍劑選擇，(4)、精子的稀釋與平衡，(5)、精子冷凍，(6)、精子復蘇，(7)、凍精復蘇后的受精效果檢驗；(1)、精液采集選擇性腺發育成熟的雄性親魚，利用150mg/L的MS222麻醉后，采用腹部擠壓法獲取精液，以吸管和干燥的1.5ml離心管收集精液，精液采集后置于冰上保存，活動率85％以上的精液樣品用于精子冷凍；(2)、基礎液選擇選用Hank`s液作為基礎液，配制方法CaCl2·2H2O0.185g/L，無水MgSO40.09767g/L，KCl 0.4g/L，Na2HPO40.06g/L，NaCl 8g/L，NaH2PO4 0.04788g/L，D-葡萄糖1g/L，NaHCO30.35g/L，以1N HCL調節pH至7.6，備用；(3)、抗凍劑選擇以基礎液終濃度的百分比15％DMSO+10％蛋黃作為抗凍保護劑；(4)、精子的稀釋與平衡將精液與預冷的4℃稀釋液按照體積比1∶2混合，然后按照要求的體積比加入抗凍劑，在冰上或4℃冰箱平衡4-6min；(5)、精子冷凍將平衡后的精液和稀釋液混合液按照每管1.8ml分裝入2ml凍存管中，按照三步降溫法進行冷凍保存；即液氮罐頸部約-15℃停留2min；液氮面上約4cm處約-160℃停留5min；再直接投入液氮中保存；(6)、精子復蘇解凍時，先將凍存管提至罐口，在液氮蒸汽中停留約3min，然后將冷凍管取出迅速置于28℃水浴中解凍60s，管中凍精外層開始融化，取出置于室溫下至完全融化；在室溫條件下，以自然海水激活精子，檢查精子活力；(7)、凍精復蘇后的受精效果檢驗人工采集成熟條斑星鰈卵子，以新鮮精液和解凍后復蘇精液分別進行人工授精；將受精卵置于循環流水孵化系統進行孵化，統計受精率和孵化率。
全文摘要
一種簡單實用的條斑星鰈精子冷凍保存的新方法，包括精液采集、基礎液選擇、抗凍劑選擇、精子稀釋與平衡、精子冷凍、精子復蘇、精子復蘇后受精效果檢驗。本發明是選取性成熟的親魚采集優質精液，選擇適宜基礎液及抗凍液，精液與基礎液按照體積比1∶2混合后，冰上或者4℃平衡5min，按照三步降溫法降溫至-160℃后停留5min，直接投入液氮中保存；解凍時，將冷凍管在液氮蒸汽中停留3min，迅速投入28℃水浴解凍60s后置于室溫下完全溶解，獲得可用于規模化苗種繁育所需的大批量的高質量精液。本發明簡單易行實用，精液保存解凍后活動率高、受精效果好，平均受精率可達到70％以上，孵化率達到50％以上，與新鮮精液的受精效果和孵化效果相同。為苗種繁育企業規模化育苗，提供了容易操作的精液長期或短期保存技術。
文檔編號A01N1/02GK101884322SQ201010230929
公開日2010年11月17日 申請日期2010年7月20日 優先權日2010年7月20日
發明者劉新富, 孫中之, 徐永江, 曲建忠, 柳學周, 王妍妍, 陳超 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所