專利名稱：心房顫動致病基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子遺傳學、細胞生物學和心臟病學領域。具體地說，本發明涉及心房顫動致病基因YQXM及其編碼蛋白。此外，本發明還涉及YQXM核苷酸序列和編碼蛋白的制備方法和用途。
背景技術：
根據世界衛生組織的定義，心房顫動(atrial fibrillation)是心房不規則的、雜亂無章的電活動，心電圖上P波消失，代之以基線上形狀、大小、方向和時程不一的顫動波，在沒有高度或完全性房室傳導阻滯情況下心室率完全不等。
心房顫動是臨床上最常見的心律失常之一，它促發心力衰竭或血流動力學障礙，誘發室速或室顫等致命性心律失常，導致血栓和栓塞事件，增加基礎心臟病的死亡率，心房顫動本身還可以引起心臟擴大。
根據統計，美國心房顫動發生率為0.9％。隨著年齡的增長，心房顫動發生率激劇增高，在65歲以上者則高達5.9％。根據Framinham研究，老年人(＞65歲)卒中1/3由心房顫動引起。歐洲心房顫動發生率與美國相仿，亞洲略低。心房顫動嚴重地危害著人類的健康，也給社會帶來了相當的經濟負擔。
1904年Mackenzie較詳細地描述了心房顫動，從此以后將近一個世紀已經過去了，然而心房顫動的發生機制依然莫衷一是，心房顫動依舊是醫學所面臨的一大挑戰。
作為心房顫動的特殊類型，特發性心房顫動指無明確的心臟病變基礎的心房顫動。其命名比較混亂，其他的名稱有孤立性特發性心房顫動、良性特發性心房顫動和家族性特發性心房顫動。多達三分之一的心房顫動歸類為特發性心房顫動(Lip GYH，Beevers DG(1995)ABC of atrial fibrillationhistory，epidemiology，and importance of atrial fibrillation.BMJ 3111361-1363)。
KCNE2是一種已知的基因(Genbank登錄號No.NM_172201)。KCNE2的其它名稱有LQT6和MIRP1。KCNE2基因位于人類21號染色體21q22.12。目前已知KCNE2有1種轉錄產物。該基因表達產物是快速激活的延遲整流鉀通道Ikr的β亞單位。已有的研究表明KCNE2本身突變因其減少Ikr電流可導致惡性心律失常和先天性長QT綜合征(LQT6)，后者還可以引起嚴重心律失常和猝死。然而，沒有公開或暗示過KCNE2與人類心房顫動有關。
在本申請之前，公開或報道與人類心房顫動有關的人類心房顫動致病基因只有KCNQ1。
因此，為了有效診斷和治療心房顫動，本領域迫切需要尋找所有與心房顫動有關的致病基因。
發明內容
本發明的目的是提供一種新的人類心房顫動致病基因-YQXM及其編碼的蛋白，以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發明的第一方面，提供了一種分離的人YQXM蛋白多肽，它選自下組具有27位氨基酸R→C突變的KCNE2蛋白，具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，或其含有氨基酸序列RIFITYMDNWCQNTTAEQE的保守性變異多肽或其活性片段或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少85％相同性(a)編碼上述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼的多肽具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；更佳地，該多核苷酸具有選自下組的序列(1)編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(2)SEQ ID NO1中1-809位的核苷酸序列；(3)SEQ ID NO1中141-512位的核苷酸序列；在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了制備YQXM多肽的制備方法，該方法包含(a)在適合表達蛋白的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出YQXM多肽。
在本發明的第五方面，提供了與上述的YQXM蛋白多肽特異性結合的抗體。
在本發明的第六方面，提供了一種組合物，它含有0.001-99wt％的本發明的YQXM蛋白多肽以及可接受的載體。還提供了野生型KCNJ2蛋白或基因的用途，它們被用于制備治療心房顫動的藥物。
在本發明的第七方面，提供了一種檢測心臟細胞是否存在心房顫動易感性的方法，它包括步驟檢測心臟細胞樣品中YQXM轉錄本與野生型KCNE2轉錄本相比是否有變化，有變化就表示存在心房顫動易感性；或者檢測心臟細胞樣品中YQXM蛋白的活性與野生型KCNE2蛋白活性相比是否有變化，有變化就表示存在心房顫動易感性；或者檢測基因組樣品中YQXM組序列與正常的KCNE2基因組序列的相比是否有變化，有變化就表示該心臟細胞存在心房顫動易感性(即該測試個體患心房顫動的概率高于正常人群)。
較佳地，所述的變化是外顯子中的核苷酸的缺失、插入、和置換突變。更佳地，所述的變化選自下組SEQ ID NO1中核苷酸219由C→T，或SEQ ID NO2中27位氨基酸由R→C。
還提供了一種體外檢測樣品是否存在KCNE2的單核苷酸多態性的方法，其特征在于，包括步驟(a)用KCNE2基因特異性引物擴增樣品的KCNE2基因，得到擴增產物；和(b)檢測擴增產物中是否存在以下單核苷酸多態性219位C→T；其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO1或Genbank登錄號No.NM_172201。
更佳地，所述的基因特異性引物具有SEQ ID NO3和4的序列。
在本發明的第八方面，提供了一種檢測心房顫動的試劑盒，它包括(1)特異性擴增人YQXM的引物對，(2)檢測擴增產物與野生型KCNE2相比是否存在變化所需的試劑。還提供了作為引物或探針的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續的15-800個核苷酸。
在本發明的第九方面，提供了本發明多肽和編碼序列的用途。例如本發明多肽可被用于篩選促進人YQXM蛋白多肽活性的激動劑，或者篩選抑制人YQXM蛋白多肽活性的拮抗劑，或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發明的人YQXM蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應。
在本發明的第十方面，提供了含有人YQXM的模型動物。較佳地，所述的模型動物選自小鼠、大鼠。
本發明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
圖1顯示了野生型的KCNE2和具有219位C→T突變的突變型KCNE2(即YQXM)的核苷酸序列的測序結果，其中，突變位點用箭頭標出，該核苷酸突變對應于氨基酸序列中第27位R→C突變。
圖2顯示了兩個在KCNE2中具有219位C→T突變的家系情況，該核苷酸突變對應于氨基酸序列中第27位R→C突變。其中，正方形表示男性，圓圈表示女性；帶斜線為死亡，實心的為發現有房顫，空心的未有房顫；箭頭表示的為先證者。
具體實施例方式
研究提示，家族性心房顫動的發生機制與可能離子通道有關，本發明人選用八個鉀離子通道候選基因(KCNQ1，HERG，KCNE1，KCNE2，KCNE3，KCNE4，KCNE5和KCNJ2)，對28個家族性房顫家系行候選基因突變篩查，在兩家系中初步明確了YQXM突變與心房顫動的關系后，排除必須數量以上無親緣關系的正常隨機個體存在同樣的基因突變，用膜片鉗進行突變功能分析，最終確立該YQXM基因是導致人類心房顫動的致病基因之一。
本發明中YQXM的特征是，它具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，與人類KCNE2基因序列不同之處為YQXM219位(SEQ ID NO1)核苷酸為T，而KCNE2基因219位核苷酸為C。
由于在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中219位核苷酸發生了C→T置換(圖1)，因此，本發明YQXM編碼具有SEQ ID NO.2所示蛋白序列。與人類KCNE2基因編碼的蛋白序列不同之處為，YQXM的第27位氨基酸(SEQ ID NO2)為半胱氨酸(Cysteine，C)，而KCNE2的第27位氨基酸為精氨酸(Arginine，R)。
在本發明中，術語“YQXM蛋白”、“YQXM多肽”或“YQXM編碼蛋白”可互換使用，都指具有人YQXM編碼蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。該術語還包括含有或不含起始甲硫氨酸的YQXM編碼YQXM蛋白。
與野生型KCNE2相比，YQXM基因就是核苷酸序列中第219位發生C→T突變的突變型KCNE2基因，而YQXM多肽就是氨基酸序列中第27位發生R→C突變的突變型KCNE2多肽。
野生型KCNE2的基因組序列列于NT_011512[gi37558541]，其CDS位于21403174-21403545，YQXM的突變位置是21403252位C→T。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的YQXM蛋白或多肽”是指YQXM多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化YQXM蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。YQXM多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括人YQXM蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的天然人YQXM蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發明中，術語“人YQXM多肽”指具有人YQXM蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與人YQXM蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人YQXM DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人YQXM多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
發明還提供人YQXM蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人YQXM多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。
修飾形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，“人YQXM蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核苷酸序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼YQXM蛋白的多聚核苷酸。
本發明的人YQXM核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或YQXM蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的YQXM多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼人YQXM多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，人YQXM多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含人YQXM編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的人YQXM蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療YQXM蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進或對抗YQXM蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人YQXM蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人YQXM蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發明還包括對人YQXM DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人YQXM產物或片段。較佳地，指那些能與人YQXM產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。一種特別優選的抗體是識別YQXM蛋白但不識別KCNE2蛋白的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制人YQXM蛋白的分子，也包括那些并不影響人YQXM蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人YQXM產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人YQXM產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人YQXM蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。本發明的各類抗體可以利用人YQXM產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人YQXM產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
本發明的YQXM編碼蛋白抗體可以用來鑒定表達YQXM編碼蛋白的細胞，如心肌細胞。例如，可以用一種可檢測的分子例如熒光素異硫氰酸(FITC)來標記YQXM編碼蛋白特異抗體，然后讓YQXM編碼蛋白特異抗體與細胞樣品接觸，再用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測出與YQXM編碼蛋白特異抗體結合的細胞。
除了在細胞表面檢測YQXM編碼蛋白外，還可以用Western印跡技術分析該蛋白質。細胞裂解液可以從培養細胞或取自病人的組織標本如心肌中提取，并溶解在含有去污劑的裂解緩沖液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞提取物(同時將提純的YQXM編碼蛋白多肽作為陽性對照)，接著通過電泳雜交將其轉移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測YQXM編碼蛋白，可以使用典型的抗體結合檢測方法，例如放射自顯影或堿性磷酸酶檢測方法。并可使用免疫接種血清或不相關的單克隆抗體作為非特異反應的對照。
還可用Nothern印跡法技術分析YQXM編碼蛋白的表達，即分析YQXM編碼蛋白RNA轉錄物在細胞中的存在與否和數量。
YQXM編碼蛋白DNA的Nothern印跡分析和YQXM編碼蛋白特異抗體的Western印跡分析可以聯合使用，以證實YQXM編碼蛋白在生物樣本中的表達。YQXM編碼蛋白DNA還可以用于Southern印跡分析或原位雜交分析，以將該基因定位于染色體上，并可進行遺傳連鎖分析以找出其它可能的疾病相關基因。
隨著人類心房顫動分子遺傳機制的部分確立，人類心房顫動基因診斷已經可能在特定人群開展。基因診斷方法包括測序技術、DNA芯片技術等。目前的測序技術和DNA芯片都可方便地檢測出某一核苷酸序列中單個或多個核苷酸的變化。一種優選的檢測方法是檢測YQXM(包括cDNA序列和基因組序列)中編碼區是否存在核苷酸變化，例如SEQ ID NO1中219位核苷酸是否由C→T。
隨著YQXM的發現，已經可以采用轉基因技術在細胞中表達相應蛋白，進而通過膜片鉗或電壓鉗技術研究心房顫動電生理。也可以通過同源重組方法和胚胎干細胞途徑或基因顯微注射法，建立遺傳性心房顫動動物模型，然后通過多導生理記錄儀等研究心房顫動電生理。該電生理基礎可能正是非應用遺傳決定的心房顫動發病的電生理機制或環節之一。
通過電生理技術在轉基因細胞模型和轉動物細胞模型上可以直接篩選心房顫動新藥先導化合物。
通過計算機可以推斷編碼蛋白空間結構，為心房顫動新藥模擬設計提供基礎。
遺傳決定的人類心房顫動發病機制的闡明有望從新的視角(離子通道)研究其它類型人類心房顫動，促成所有類型人類心房顫動的研究取得突破性進展。
遺傳決定的人類心房顫動的新藥的發掘和優化可能促成所有類型人類心房顫動的研究取得突破性進展。
利用本發明蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與YQXM蛋白發生相互作用的物質，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下或局部給藥。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的野生型KCNE2多肽以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的野生型KCNE2施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約1微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約5毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
基于本發明，來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將野生型KCNE2轉移至細胞內。構建攜帶野生型KCNE2的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al.)。另外KCNE2可包裝到脂質體中，然后再轉移至細胞內。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
能與人YQXM蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對人YQXM蛋白分子進行標記。
本發明還涉及定量和定位檢測人YQXM蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人YQXM蛋白水平，可以用作解釋人YQXM蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷YQXM蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在YQXM蛋白的方法是利用YQXM蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與YQXM蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在YQXM蛋白。
YQXM蛋白的多聚核苷酸可用于YQXM蛋白相關疾病(如心房顫動)的診斷和治療。一種方法是檢測YQXM的突變，以診斷心房顫動疾病或心房顫動易感性。YQXM蛋白突變的形式包括與野生型KCNE2 DNA序列相比的其他點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等，尤其是位于外顯子中突變形式。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。此外，本發明多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于基因診斷。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1YQXM的識別在本實施例中采用的識別YQXM的策略為(1)研究表明，家族性心房顫動的發生機制可能與離子通道有關；(2)本發明人在28個家族性房顫家系中對八個鉀離子通道候選基因(KCNQ1，HERG，KCNE1，KCNE2，KCNE3，KCNE4，KCNE5和KCNJ2)的外顯子測序篩查，尋找可能致病的基因突變；(3)在兩個家系中初步明確YQXM突變與心房顫動的關系后，進一步排除必須數量以上正常隨機個體存在同樣的基因突變的可能性；(4)用膜片鉗行突變體功能分析，最終確立該YQXM或編碼蛋白質導致人類心房顫動。
在本實施例中，按照上述策略確定識別YQXM的步驟為(1)確定候選基因；(2)候選基因的測序篩查；(3)排除必須數量以上正常隨機個體存在同樣的基因突變的可能性；(4)用膜片鉗行突變體功能分析，最終確立該YQXM或編碼蛋白質導致人類心房顫動。具體過程如下
根據已有的研究，在本實施例中，分析了一種快速激活的延遲整流鉀通道Ikr(β亞單位)基因-KCNE2的外顯子。根據KCNE2基因序列，應用Primer3軟件設計多對擴增外顯子的引物并合成。其中，可擴增出YQXM突變位置的引物序列如表1所示表1 引物序列
采用常規的Touchdown方法做PCR，PCR反應體系主要含有如下成分
反應的總體積為25ul，用ddH2O來補足體積。
將加好樣的薄壁PCR管放入PTC-220熱循環儀上進行PCR反應。PCR反應條件預變性95℃15min，隨后變性94℃30s，退火64℃45s，延伸72℃1min，共35個循環，最后延伸72℃8min。取PCR產物，在含0.5μg/μl溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠中電泳，證實擴增效果。PCR擴增的目的片段經電泳鑒定和純化后，用DYEnamicTMET dye terminator kit(Amershan Biosciences)進行雙向測序反應。測序反應條件95℃變性20s，50℃退火15s，60℃延伸1min，25個循環。產物經醋酸胺、乙醇沉淀純化后，在MegaBACE500自動測序儀進行核苷酸序列測定。通過Sequence analyzer軟件和肉眼對測序結果進行分析，綜合正反雙向序列結果識別突變。
經過測序結果和“基因型-表現型”分析，初步證實KCNE2基因存在致病突變，并且KCNE2第219位的突變與心房顫動特別相關(圖1，箭頭處為KCNE2基因突變點)。之后，在1204例無血緣關系的健康對照中未發現KCNE2的219位C→T突變。功能研究顯示KCNE2的R27C突變導致KCNQ1-KCNE2獨特的“功能獲得”性改變，最終確定YQXM基因或其編碼蛋白質可導致人類心房顫動。
YQXM基因具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，其中開放閱讀框位于141-512，其編碼蛋白具有SEQ ID NO2所述的氨基酸序列。
與正常的野生型KCNE2基因(Genbank登錄號No.NM 172201)和編碼蛋白相比，YQXM基因和蛋白存在以下變化SEQ ID NO1中核苷酸219由C→T，SEQ ID NO2中27位氨基酸由R→C。
討論圖2顯示了2個具有YQXM的家系的情況。
這些家系的臨床特點如下所示表1 心房顫動家系情況(+為死亡年齡，為目前年齡)
此外，并非所有的KCNE2 R27C突變者都表現出房顫(如家系1中的II-1，II-5，II-6和家系2中II-3，II-6)，解釋原因如下(1)、陣發性房顫偶然發生，持續時間短，這樣，雖有房顫發生，但是不一定能記錄到；(2)、延遲外現。房顫多發生于年老年人。某些突變攜帶者還未到發病年齡；(3)、KCNE2R27C突變外顯不全；(4)、KCNE2R27C突變僅為房顫的易患因素，環境因素在房顫的發生中具有一定的作用。
在對包括KCNE2 R27C在內的多個KCNE2的突變型進行的功能研究發現長LQ綜合征(LQT)相關的KCNE2突變-KCNE2T8A、KCNE2Q9E和KCNQ1在COS-7細胞中共表達時，和KCNE2R27C相比，明顯抑制KCNQ1-KCNE2電流，而不是增大其電流，當本發明人將KCNE2R27C和HCN1、HCN2和HCN4共表達時，并未改變KCNE2-KCN家族的電流。相對于所有LQT相關的KCNE2突變(Q9E和T8A)，KCNE2R27C突變導致獨特的KCNQ1-KCNE2“功能獲得”性效應。此外，該突變未影響與LQT發生相關的HERG-KCNE2電流。
實施例2遺傳性心房顫動動物模型的建立采用人的KCNE2 cDNA探針掃描129Sv小鼠基因組文庫，克隆小鼠基因組KCNE2基因。經PCR、酶切圖譜分析和鳥槍法測序證實后，挑選位于小鼠KCNE2上下游的片段，與含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列以及新霉素抗性基因和TK基因聯接后，特異性地同源重組于小鼠KCNE2基因位點。使轉染的ES細胞能夠進行雙重藥物選擇(G418和Gancyclvir)，使篩選同源重組的ES細胞克隆的范圍縮小。所獲得的ES細胞克隆經PCR和Southern印跡分析證實其正確的同源重組，并經核型分析后注射到C57BL/6品系小鼠的胚泡(blastocysts)內，再將注射的胚泡植入受體小鼠子宮內。篩選出新生小鼠的嵌合體(chimera)，則將其與正常小鼠交配，以獲得經生殖細胞遺傳的雜合體。雜合體的互相交配，獲得YQXM導入(knock-in)的純合體動物。
YQXM導入的嵌合體、雜合體和純合體動物與正常同系小鼠相比，在電生理方面、整體動物水平、細胞水平和分子水平上出現的任何差異，一經證實，可視為基因導入的表型，具體研究方法將視動物表型的不同而采取適當的方法加以研究。總而言之，研究方法主要有兩個方面，一是YQXM導入小鼠的產生；二是動物表型的分析。
實施例3YQXM編碼蛋白的制備和提純在該實施例中，將全長的YQXM序列或片段構建入商品化的蛋白質融合表達載體之中，以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進行原核表達，并提純重組蛋白。
(1)原核表達載體的構建，以及轉化大腸桿菌根據YQXM編碼蛋白全長編碼序列(SEQ ID NO.1)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物(分別對應于編碼序列5′和3′端的約20個以上核苷酸)，并在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這根據選用的pGEX-2T載體而定)，以便構建表達載體。用實施例1中獲得的YQXM擴增產物為模板，經PCR擴增后，將YQXM在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鑒定好的表達載體利用CaCl2方法轉入大腸桿菌DH5α，篩選鑒定得到含有pGEX-2T-YQXM表達載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-YQXM。
(2)表達GST-YQXM重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-YQXM工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中振搖培養過夜，按1∶100的濃度吸取培養液于新的LB培養基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養約3小時，至OD600達0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續于37℃分別培養0，1，2，3小時。取培養時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達GST-YQXM融合蛋白的工程菌。
(3)GST-YQXM融合蛋白的提取純化按上述方法誘導表達GST-YQXM融合表達蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-YQXM。誘導后的細菌離心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細菌，超聲破碎細菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉淀結合了GST-YQXM的谷胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗兩次，而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果，獲得的重組YQXM融合蛋白的分子量與預計分子量相符。
實施例4YQXM編碼蛋白或多肽在昆蟲細胞中進行真核細胞表達
(1)YQXM桿狀病毒表達載體的構建及轉染Sf9昆蟲細胞株根據YQXM的全長編碼序列(SEQ ID NO.1)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，從而構建表達載體。將YQXM cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pVL1392載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達載體3μg，野生型線性桿狀病毒DNA(BaculoGoldTMACMNPV DNA，Pharmingen，San Diego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml無血清的昆蟲培養基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)Sf9昆蟲細胞懸液于60mm組織培養板中，貼壁1小時后換轉染培養基，室溫孵育15分鐘后棄培養基，加入前面制備好的DNA載體轉染混合物，Parafilm密封培養板，于室溫27℃振搖培養4小時，而后換完全培養基培養3天，收集上清備用。
(2)轉入重組表達載體的昆蟲細胞株的篩選鑒定轉染3天后的昆蟲細胞用新鮮培養基制成細胞懸液(2×106/1ml)，取1ml細胞懸液置于60mm組織培養皿中，加入3ml培養基，100μl收集的培養上清，貼壁1小時，棄2ml培養基，繼續室溫培養1小時，棄去所有的培養基，加入預熱的含20μl 4％ X-gal的3ml半固體培養基，培養5-7天后挑取白色細胞克隆于96孔培養板中培養3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆蟲細胞。
收集感染的細胞進行Western鑒定。將細胞裂解后進行SDS-PAGE電泳，電泳后的膠于Pharmacia的Multiphor II半干電轉移儀中將蛋白質轉印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時，而后于抗YQXM編碼蛋白的抗體溶液中封閉1小時，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而后將膜置于生物素標記的抗YQXM編碼蛋白一抗的第二抗體溶液中振搖1小時，TBS清洗，加入親和素-堿性磷酸酶復合物反應30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達人YQXM的Sf9細胞克隆。
(3)YQXM編碼蛋白提取純化用高表達YQXM編碼蛋白的Sf9細胞克隆的上清大量感染Sf9細胞，感染48小時后收集細胞，PBS洗滌。每2×108細胞加入20ml細胞裂解液(0.5％TritonX-100，20mM Na3PO4(磷酸鈉，pH7.8)，500mM NaCl，1mM Na3VO4(釩酸鈉)，1mMPefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細胞，12000×g離心20min去除細胞碎片，上清按每2×108的細胞加入2ml NTA-瓊脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小時。而后用含100nM咪唑的His緩沖液洗滌兩次，用含20mM N，N′-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的緩沖液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存于4℃，并進行SDS-PAGE電泳檢測提取的YQXM編碼蛋白的純度。根據分子量識別YQXM編碼蛋白。
實施例5抗YQXM編碼蛋白抗體的制備(1)免疫小鼠和脾細胞的制備將實施例3中獲得的人YQXM蛋白用層析法進行分離后備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，并用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天后，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾細胞制備，制備飼養細胞，和細胞融合按常規方法進行。
(2)抗體的檢測在細胞融合10-15天后，需逐孔進行檢查，一旦發現旺盛的雜交細胞集落生長，就應用人YQXM蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫熒光試驗、發射免疫試驗(RIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后，立刻進行克隆培養，并分離出抗體。
結果表明，分離出的抗體可以與YQXM蛋白發生特異性結合。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>同濟大學<120>心房顫動致病基因及其用途<130>046553<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>809<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(141)..(512)<223>
<400>1gtaaggtgaa ggtgcccagc aggctgaggc ttgtgtgcaa cccagaagag agctcgctaa 60cgccagcaag aaggttcaga acagcctggc tttggaaagg aatttcatcc tgcccacaca120ctgcatagca ggagggaagc atg tct act tta tcc aat ttc aca cag acg ctg173Met Ser Thr Leu Ser Asn Phe Thr Gln Thr Leu1 5 10gaa gac gtc ttc cga agg att ttt att act tat atg gac aat tgg tgc 221Glu Asp Val Phe Arg Arg Ile Phe Ile Thr Tyr Met Asp Asn Trp Cys15 20 25cag aac aca aca gct gag caa gag gcc ctc caa gcc aaa gtt gat gct 269Gln Asn Thr Thr Ala Glu Gln Glu Ala Leu Gln Ala Lys Val Asp Ala30 35 40gag aac ttc tac tat gtc atc ctg tac ctc atg gtg atg att gga atg 317Glu Asn Phe Tyr Tyr Val Ile Leu Tyr Leu Met Val Met Ile Gly Met45 50 55ttc tct ttc atc atc gtg gcc atc ctg gtg agc act gtg aaa tcc aag 365Phe Ser Phe Ile Ile Val Ala Ile Leu Val Ser Thr Val Lys Ser Lys60 65 70 75aga cgg gaa cac tcc aat gac ccc tac cac cag tac att gta gag gac 413Arg Arg Glu His Ser Asn Asp Pro Tyr His Gln Tyr Ile Val Glu Asp80 85 90
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<400>3ctccctccca cctttacata gc 22<210>4<211>22<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4tgtctggacg tcagatgtta gc 2權利要求
1.一種分離的YQXM多肽，其特征在于，它選自下組具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，或其含有氨基酸序列RIFITYMDNWCQNTTAEQE的保守性變異多肽或其活性片段或其活性衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權利要求1或2所述多肽的多核苷酸；(b)與(a)中所述多核苷酸互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸含有選自下組的核苷酸序列(1)編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(2)SEQ ID NO1中1-809位的核苷酸序列；(3)SEQ ID NO1中141-512位的核苷酸序列；
5.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它被權利要求5所述的載體轉化或轉導的宿主細胞。
7.一種制備人YQXM多肽的方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達蛋白的條件下，培養權利要求6所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出人YQXM多肽。
8.一種能與權利要求1所述的人YQXM蛋白特異性結合的抗體。
9.一種檢測心房顫動的試劑盒，其特征在于，它包括(1)特異性擴增人YQXM的引物對，(2)用于檢測擴增產物與野生型KCNE2相比是否存在變化所需的試劑。
10.一種制備遺傳性心房顫動的動物摸型的方法，所述的動物是非人哺乳動物，其特征在于，該方法包括步驟(a)將一種遺傳構建物轉入動物細胞，所述的遺傳構建物包括5′同源臂和3′同源臂，以及位于同源臂之間的供篩選的標記基因和引入YQXM外顯子的突變元件，所述的突變元件是編碼RIFITYMDNWCQNTTAEQE的核苷酸序列，并且所述的5′同源臂和3′同源臂分別同源于基因組中人YQXM外顯子的突變元件上游和下游的核苷酸序列；(b)通過同源重組，獲得基因組整合入有突變元件的動物細胞；(c)從步驟(b)的動物細胞再生獲得轉基因動物。
全文摘要
本發明公開了一種新的人類心房顫動致病基因(YQXM)及其編碼蛋白。該YQXM是KCNE2基因的一種突變體，核苷酸突變位點發生在KCNE2的第219位(編號按Genbank登錄號No.NM 172201)。此外，本發明還涉及YQXM核苷酸序列和編碼蛋白的制備方法和用途。
文檔編號A01K67/00GK1746186SQ20041006626
公開日2006年3月15日 申請日期2004年9月10日 優先權日2004年9月10日
發明者陳義漢, 劉懿, 楊奕清 申請人:同濟大學