專利名稱：離體培養和秋水仙素處理結合選育多倍體毛泡桐的方法
技術領域：
本發明涉及離體培養和秋水仙素處理結合選育多倍體毛泡桐，屬于多倍體樹木育種的技 術領域。
背景技術：
從植物進化的趨勢看，70%以上的被子植物是多倍體(Masterson J. Stomatal size in fossil plants: evidence for polyploidy in majority of肌giosperms. Science, 1994， 264: 421-424)。多倍體 植物具有的巨大性、強優勢性、抗逆性和低結實性特別有利于樹木新品種選育(康向陽.林 木多倍體育種研究進展.北京林業大學學報，2003， 25(4): 70-74;李云，馮大領.木本植物多 倍體育種研究進展.植物學通報，2005， 22(3): 375-382)。泡桐既是著名的速生用材樹種，又 具有先花后葉，繁花如云的特點，而成為重要的城市行道樹和園地景觀樹種。但是泡桐尚存 在易發生叢枝病(任國蘭.泡桐叢枝病的研究現狀與進展.河南農業大學學報，1996, 30(4): 358-364:張春立，林木蘭，胡勤學，黃文晉.泡桐叢枝病類菌原體DNA的分子克隆與序列 分析.植物學報，1994， 36(4): 278-282)和過早結實消耗過多營養的問題。為了解決這兩個問 題，本申請專利之前，國內外對泡桐的組織培養研究主要在組織培養植株再生(施士爭，倪 善慶.泡桐組織培養系統性研究初報.江蘇林業科技，1995， 22(3): 20-22;范國強，翟曉巧， 蔣建平，劉心誠.不同種泡桐葉片愈傷組織誘導及其植株再生.林業科學，2002 ， 38 (1): 29-35)、體細胞胚胎發生與人工種子生產(Ipekci Z， Gozukirmizi N. Direct somatic embryogenesis and synthetic seed production from戶aw/ow"Za e/o"ga/a. Plant Cell Reports, 2003, 22: 16>24)和原生質體培養(衛志明，鐮田博，原田宏.從白花泡桐葉片原生質體再生植株.植 物組織培養，1991， 8 (2): 111-113)等方面，而在樹木多倍體品種選育方面主要采用自然 變異利用，如毛白楊天然三倍體(朱之悌，康向陽，張志毅.毛白楊天然三倍體選種研究.林 業科學，1998， 34(4): 22-31)、銀白楊三倍體(Seitz F W. The occurrence of triploid after self pollination of anomalous androgenous flowers of a Grey Poplar. Z. forstgenetj 1954， 3(1): 1>6)等， 以及在活體G'/iv^o)情況下通過物理和化學因素處理誘導種子、萌芽形成多倍體(趙彥華， 吳國良，藥文生.果樹多倍體育種研究進展.山西果樹，2004， (4): 35-36;李云，朱之悌， 田硯亭，張志毅，康向陽.極端溫度處理白楊雌花芽培育三倍體植株的研究.北京林業大學 學報，2000， 22(5): 7-12;楊新華，楊今后，駱承軍.桑樹多倍體育種的回顧與展望.浙江農 業科學，2000, (6): 304-308)。但是，利用自然突變體的幾率是很低的，利用物理或化學因 素活體處理樹木種子或萌芽，由于發生加倍變化的細胞和未發生變化的二倍體細胞共同生長 在一起，兩者競爭發育會產生嵌合體，更多情況下二倍體細胞常常將已加倍細胞排擠掉，加 上物理、化學處理導致的傷害，使加倍處理材料難以成活，從而導致活體誘導加倍形成多倍 體樹木的頻率很低(<5%)。發明內容本發明的目的是提出一種利用組織培養細胞的無菌性好、離散性強和再生力高的特點， 結合秋水仙素處理選育多倍體毛泡桐的方法。解決多倍體樹木成活難頻率很低的問題，從而 高效地培育多倍體樹木。本發明的技術方案為a.選擇親本；b.以胎座為最佳外植體；C.胎座愈傷組織誘導；d.胎 座愈傷組織加倍處理；e.處理后愈傷組織恢復培養；f.愈傷組織分化培養；g.芽苗生根培養；h.組培苗的移栽；i.毛泡桐植株多倍性的形態學鑒定；j.毛泡桐植株多倍性的染色體數鑒定； k.毛泡桐植株多倍性的流式細胞儀分析鑒定；l.開花期毛泡桐植株多倍性鑒定。 本發明的具體過程為a. 選擇親本選擇優良的生長健壯、無叢枝病已開花的毛泡桐(戶mz/ow"/fl to;we"to加)植株為組織培 養取材的毛泡桐株。b. 以胎座為最佳外植體從毛泡桐植株中取枝條莖段、葉片和開花后30 35天果實中的胎座為外植體進行培養。 污染率、愈傷組織誘導率和愈傷組織分化出芽率比較，發現胎座是最佳外植體。c. 胎座愈傷組織誘導采取開花后30 35天無胚珠的胎座在MS+2, 4-D0.5-2.0 mg/1 (或NAA0.7-1.2mg/1) + 6BA0.1mg/l+sucrose3。/。+agar0.75。/。的培養基中，25。C土rC黑暗條件下培養30 35天，胎 座上誘導出淺黃色、較松散的愈傷組織。d. 胎座愈傷組織加倍處理將胎座愈傷組織轉入到MS+2， 4-D0.5-2.0 mg/1 (或NAA0.7-1.2mg/l) +6BA0.1mg/l+ sucrose3n/。+秋水仙素0.05%-0.075%的液體培養基中置于105 110rpm的恒溫搖床上在22 25。C旋轉培養48 72hr。e. 處理后愈傷組織恢復培養在無菌工作臺上取出處理培養的愈傷組織，經無菌水沖洗3次后接種于MS + 2， 4-D0.5-2.0 mg/1 (或NAA0.7-1.2mg/1) +68八0.1加§/1+311<;10863%+&輕010.75%的培養基中，25'c土rc黑暗條件下恢復培養7 io天，處理后淺黃褐色的愈傷組織生長出淺黃色愈傷組織。f. 愈傷組織分化培養將恢復后的愈傷組織轉至U MS + NAA0.3^0.5mg/l + 6BA2.0-3.0mg/1 + sucrose2% + agar0.75。/o的培養基中，光強1500 2000 Lux、 12hr/d， 25。C土rC分化培養，此后20 45天 愈傷組織陸續分化出芽苗。&芽苗生根培養待芽苗生長到3.0 6.0cm高，具有3.5 7.0片葉時，將它們分株轉移至2/3MS + IBA0.5-1.0 mg/1+NAA0.l-0.5mg/1 +活性炭0.03%-0.05%+sucrose2%+agar0.75o/o的培養基 中，光強1500 2000 Lux、 12hr/d， 25°C士1。C條件下生根培養，10 35天后芽苗陸續分化 出根。h. 組培苗的移栽當生根的組培苗具有7.0 10.0片葉，株高5.0 10.0cm時，將培養它們的玻瓶蓋打開， 加入剛蓋住培養基表面的無菌水，放置到靠近窗臺能接收散射光的試驗臺上煉苗1 2天， 然后用鑷子取出組培苗在自來水中清洗干凈根部的培養基，再將它們移栽到已滅菌的裝有2/3 細砂+1/3園土為基質的泥缽中，用小噴霧器向小苗和基質噴水，再罩上薄膜保持相對濕度 90%左右，上蓋遮陽網，連續3天后，逐漸揭開薄膜，適時噴水保濕，在移栽后的第3天、 第7天、第15天分別噴施1/10MS大量元素促進試管苗的成活，移栽15天后揭去遮陽網， 30天后將缽中生長的毛泡桐小苗移栽到田間。i. 毛泡桐植株多倍性的形態學鑒定從外部形態上觀察，多倍體毛泡桐的葉片為卵圓形、葉片邊緣有小鋸齒狀缺刻，二倍體 毛泡桐的葉片為五角形、葉片全緣；取試管苗或幼小毛泡桐的葉片下表皮在顯微鏡下觀察氣 孔數目，多倍體毛泡桐為314.30±15.57/mm2, 二倍體毛泡桐為576.70±28.25/mm2;氣孔長 度，多倍體毛泡桐為35.82土3.63um, 二倍體毛泡桐為19.11 ±2.42nm;氣孔寬度，多倍體 毛泡桐為24.87±2.44um， 二倍體毛泡桐為15.78土1.95um;氣孔保衛細胞中的葉綠體數， 多倍體毛泡桐為21.19±3.61個/氣孔保衛細胞，二倍體毛泡桐為11.41 ± 1.44個/氣孔保衛細5胞。j.毛泡桐植株多倍性的染色體數鑒定在顯微鏡下觀察毛泡桐組培苗根尖染色體。四倍體毛泡桐的染色體數是2n=80, 二倍體 毛泡桐為2n=40。k毛泡桐植株多倍性的流式細胞儀分析鑒定采取毛泡桐試管苗或者幼小植株的新鮮葉片50mg進行流式細胞儀分析。將葉片制取細 胞核懸浮液后，取出0.5ml用含有1 ii 1 RNase (10mg/ml)的碘化丙啶(2mg/ml) 50ul染色， 然后在37^±0.5°(:下溫育30min，然后將懸浮液置于流式細胞儀下分析，每個葉片最少有 8000個核被測定分析。所獲的分析結果是四倍體毛泡桐的DNA熒光值在213.0 228.0,而 二倍體毛泡桐為114.0。l.開花期毛泡桐植株多倍性鑒定取開花期毛泡桐的花朵各5朵，分別測定花朵長度、花萼長、花萼寬、花絲長度、花藥 長、花藥寬、花柱長及子房長度和直徑。四倍體毛泡桐的花器明顯比二倍體毛泡桐的花器大。 花朵長度四倍體為9.73士0.55cm， 二倍體為7.13士0.12cm;花萼長度四倍體為2.24土0.21cm, 二倍體為2.01土0.11cm;花萼寬度四倍體為U6土0.03cm， 二倍體為0.85±0.01 cm;花絲長 度四倍體為3.37土0.48cm， 二倍體為1.80土0.02cm;花藥長度四倍體為0.51 士0.02cm， 二倍 體為0.36土0.05cm;花藥寬度四倍體為0.22土0.01cm， 二倍體為0.11 土0.01cm;花柱長度四 倍體為3.10土0.05cm， 二倍體為2.61土0.01cm;子房長度四倍體為1.10土0.08cm， 二倍體為 0.62士0.01cm;子房直徑四倍體為0.82士0.02cm, 二倍體為0.41士0.02cm。四倍體毛泡桐的 結實率為0， 二倍體毛泡桐的結實率為27.5%~62.3%。本發明就是利用組織培養中胚性細胞的無菌性、離散性和強再生性特點，在適當時間適 當濃度秋水仙素處理下使毛泡桐的愈傷組織細胞染色體加倍，加倍后的細胞經恢復培養、分 化出芽、再生出根后，能夠獨立形成完整的多倍體毛泡桐。而那些經處理而未加倍的毛泡桐 細胞也獨立分化出芽、再生出根形成完整植株，兩者各自來源于單個或少數細胞，彼此獨立 發育形成植株，因此很少形成嵌合體，而且這種離體誘導情況下，經過恢復培養減輕了秋水 仙素處理的毒害作用，已加倍的毛泡桐細胞能正常分化出芽直至形成完整植株，從而獲得較 高的誘導多倍體頻率。解決現有技術中多倍體樹木成活難頻率很低的問題，從而能夠迅速高 效地培育多倍體樹木。本發明所產生的四倍體毛泡桐具有花大、葉厚為卵圓形、不結實等具有更好觀賞性和節 約營養的特點。 附圖及說明
圖1是本發明的愈傷組織分化出芽； 圖2是本發明的生根的芽苗；圖3是本發明田間生長的毛泡桐植株，其中A為二倍體，B為四倍體； 圖4是本發明的毛泡桐葉片形態，其中A為二倍體，B為四倍體； 圖5是本發明毛泡桐染色體數的鑒定，其中A為二倍體(2n=40)， B為四倍體(2n-80); 圖6是本發明毛泡桐的流式細胞儀分析鑒定，其中A為二倍體，B、 C、 D為四倍體； 圖7是本發明的毛泡桐花朵多倍性鑒定，其中A為花朵，B為花萼,C為花藥，D為子房具體實施方式
下面以實施例對本發明進一步說明 實施例1.四倍體毛泡桐新品系"毛泡桐108"的選育 i選擇親本以優良的無叢枝病、已開花的毛泡桐植株洪山008為組織培養取材的親本。 b.以胎座為最佳外植體從洪山008毛泡桐植株上取枝條莖段、葉片和開花后30 35天的果實中的胎座為外植 體進組織培養。經培養污染率(污染外植體粉接種外植體總數X 100%)、愈傷組織誘導率(愈 傷組織塊^/接種外植體數X100。/0)和愈傷組織分化出芽率(分化出芽愈傷組織數/愈傷組織 總數X100M)比較發現，胎座為外植體的污染率為0，愈傷組織誘導率為100%，愈傷組織 分化出芽率90.0%，是最佳外植體。c. 胎座愈傷組織誘導采取開花后30 35天無胚珠的胎座在MS+2， 4-D0.5mg/l+6BA0.1mg/l+sucrose3°/o+ agar0.75。/。的培養基中，25'C土1'C黑暗條件下培養30 35天后，100%的胎座上誘導出淺黃 色較松散的愈傷組織。d. 胎座愈傷組織加倍處理將愈傷組織轉入到MS+2， 4-D0.5 mg/l+6BA0.1mg/l+sucrose3n/。+秋水仙素0.05%的液 體培養基中置于105rpm的恒溫搖床上在22'C 土 1 'C旋轉培養48 hr。e. 處理后愈傷組織恢復培養按無菌操作要求，取出處理培養的愈傷組織，經無菌水沖洗3次后接種于MS+2，4-D0.5 mg/l+6BA0.1mg/l+sucrose3W+agar0.75n/。的培養基中，25。C土rC黑暗條件下恢復培養7天， 處理后的愈傷組織從淺黃褐色逐漸有部分生長出淺黃色的愈傷組織。f. 愈傷組織分化出芽(見附圖l)將恢復后的愈傷組織轉到MS+NAA0.3mg/l+6BA2.0mg/l+sucrose2o/。+agar0.75o/n的培 養基中，光強1500 2000Lux、 12hr/d， 25'C土1。C分化培養，此后20 45天后愈傷組織陸 續分化出芽苗，分化率30.7%。g. 芽苗生根培養(見附圖2)待芽苗生長到3.0 6.0cm高，具有3.5 7.0片葉時，將它們分株轉移至2/3MS + IBA0.5mg/l+NAA0.1mg/l+活性炭0.03。/o+sucrose2。/o+agar0.75n/。的培養基中，光強1500 2000Lux、 12hr/d, 25'C土rC條件下生根培養，10 35天后100%的芽苗分化出根。h. 組培苗的移栽當生根的組培苗具有7.0 10.0片葉，株高5.0 10.0cm時，將培養它們的三角瓶瓶塞打 開，加入無菌水，放置到靠近窗臺的實驗臺上煉苗2天；然后用鑷子取出組培苗在自來水中 清洗干凈試管苗根部的培養基，再將它們移栽到已滅菌的裝有2/3細砂+1/3園土為基質的 泥缽中，用小噴霧器向小苗和基質噴水，再罩上薄膜保持相對濕度90%左右，上蓋遮陽網， 連續3天后，逐漸揭開薄膜，適時噴水保濕，在移栽后的第3天、第7天、第15天分別噴 施1/10MS大量元素促進試管苗的成活。移栽15天后揭去遮陽網，30天后將缽中生長的毛 泡桐小苗移栽到田間(見附圖3)。L毛泡桐植株多倍性的形態學鑒定(見附圖4)從葉形、下表皮氣孔數目、氣孔大小和葉綠體數目上比較多倍體和二倍體毛泡桐。多倍 體毛泡桐的葉片為卵圓形、葉片邊緣有小鋸齒狀缺刻，二倍體毛泡桐的葉片為五角形、葉片 全緣;取試管苗或幼小毛泡桐的葉片下表皮在顯微鏡下觀察氣孔數目，多倍體毛泡桐為314.30 ±15.57/mm2， 二倍體毛泡桐為576.70±28.25/mm2;氣孔長度，多倍體毛泡桐為35.82±3.63 iim, 二倍體毛泡桐為19.11 ±2.42um;氣孔保衛細胞中的葉綠體數，多倍體毛泡桐為21.19 ±3.61個/氣孔保衛細胞，二倍體毛泡桐為11.41 ± 1.44個/氣孔保衛細胞。j.毛泡桐植株多倍性的染色體數鑒定在顯微鏡下觀察毛泡桐組培苗根尖染色體。四倍體毛泡桐的染色體數是2ii=80, 二倍體 毛泡桐為2nK)(見附圖5)。k毛泡桐植株多倍性的流式細胞儀分析鑒定(見附圖6)采取毛泡桐移栽試管苗幼小植株的新鮮葉片50mg進行流式細胞儀分析。將葉片制取細 胞核懸浮液后，取出0.5ml用含有1 ii 1 RNase (10mg/ml)的碘化丙啶(2mg/ml) 50u 1染色，然后在37。C土0.5'C下溫育30min,然后將懸浮液置于流式細胞儀下分析，每個葉片最少有 8000個核被測定分析。所獲的分析結果是3株四倍體毛泡桐的DNA熒光值分別為228.0、 213.0、 218.0,而二倍體毛泡桐為114.0，四倍體毛泡桐基本上是二倍體的2倍。 l.開花期毛泡桐植株多倍性鑒定(見附圖7)取開花期毛泡桐的花朵各5朵，分別測定花朵長度及花器官部分值，四倍體毛泡桐的花 器明顯比二倍體毛泡桐的大。花朵長度四倍體為9.73土0.55cm， 二倍體為7.13土0.12cm;花 萼長度四倍體為2.24±0.21 cm， 二倍體為2.01 土0.11cm;花萼寬度四倍體為1.16土0.03cm， 二倍體為0.85土0.01cm;花絲長度四倍體為3.37土0.48cm， 二倍體為1.80士0.02cm;花藥長 度四倍體為0.51土0.02cm, 二倍體為0.36土0.05cm;花藥寬度四倍體為0.22土0.01cm， 二倍 體為0.11土0.01cm;花柱長度四倍體為3.10土0.05cm, 二倍體為2.61 ±0.01 cm;子房長度四 倍體為1.10土0.08cm, 二倍體為0.62土0.01cm;子房直徑四倍體為0.82土0.02cm, 二倍體為 0.41土0.02cm。此外，106株四倍體毛泡桐的結實率為0， 二倍體毛泡桐的結實率為 27.5%~62.3%。本發明產生的四倍體毛泡桐新品系"毛泡桐108"具有花大、葉厚卵圓形、不結實等更 好的觀賞性和節約營養的特點。
權利要求
1.一種以胎座為外植體的離體培養和秋水仙素處理結合選育多倍體毛泡桐的方法，其特征在于過程為a.選擇親本；b.以胎座為最佳外植體；c.胎座愈傷組織誘導；d.胎座愈傷組織加倍處理；e.處理后愈傷組織恢復培養；f.愈傷組織分化培養；g.芽苗生根培養；h.組培苗的移栽；i.毛泡桐植株多倍性的形態學鑒定；j.毛泡桐植株多倍性的染色體數鑒定；k.毛泡桐植株多倍性的流式細胞儀分析鑒定；l.開花期毛泡桐植株多倍性鑒定。
2. 根據權利要求1所述的離體培養和秋水仙素處理結合選育多倍體毛泡桐的方法，其特 征在于具體過程為a. 選擇親本以優良的無叢枝病已開花的毛泡桐植株為取材的親本；b. 以胎座為最佳外植體以開花后30 35天果實中的胎座為最佳外植體進行組織培養； C.胎座愈傷組織誘導采取開花后30 35天無胚珠的胎座在MS+2, 4-D0.5-2.0 mg/1 (或NAA0.7-1.2mg/1) + 6BA0.1mg/l+sucrose3o/。+agar0.75。/。的培養基中，25°C ± 1 'C黑暗條件下誘導愈傷組織形成；d. 胎座愈傷組織加倍處理將旺盛生長、淺黃色較松散的愈傷組織轉到MS+2， 4-D0.5-2.0 mg/l(或NAA0.7-1.2mg/l) +68八0.1 1§/1+811(: ^3%+秋水仙素0.05%-0.075%的液體培養基中，置于105 110rpm的 恒溫搖床上在22 25。C旋轉培養48 72 hr;e. 處理后愈傷組織恢復培養無菌取出處理后的愈傷組織，經無菌水沖洗3次后接種于MS+2, 4-D0.5-2.0 mg/1 (或 NAA0.7-l,2mg/1) +68八0.1!118/1+511 0863°/。+紹310.75%的培養基中，25。C土1。C黑暗條件下 恢復培養7~10天，處理后淺黃褐色愈傷組織生長出淺黃色愈傷組織；f. 愈傷組織分化培養將恢復后的愈傷組織轉到MS + NAA0.3-0.5mg/l + 6BA2.0-3.0mg/1 + sucrose2% + agar0.75。/。的培養基中，光強1500 2000 Lux、 12 hr/d， 25。C土TC分化培養，直至分化出芽苗*'g.芽苗生根培養待芽苗生長到3.0 6.0cm高，具有3.5 7.0片葉時，將它們分株轉移至2/3MS + IBA0.5-1.0mg/l+NAA0.1-0.5mg/l+活性炭0.030/W).05。/o+sucrose2o/o+agar0.75o/o的培養基中 光照培養生根；h. 組培苗的移栽當生根的組培苗具有7.0 10.0片葉，株高5.0 10.0cm時，經煉苗后，徹底洗凈組培苗 根部的培養基，移栽到已滅菌的裝有2/3細砂+1/3園土為基質的泥缽中,'噴水罩薄膜保持 相對濕度卯％左右，上蓋遮陽網，連續3天后，逐漸揭開薄膜，適時噴水保濕，在移栽后的 第3天、第7天、第15天分別噴施1/10MS大量元素促進試管苗的成活，移栽15天后揭去 遮陽網，30天后將小苗移至田間；i. 毛泡桐植株多倍性的形態學鑒定多倍體毛泡桐的葉片為卵圓形、葉片邊緣有小鋸齒狀缺刻，二倍體毛泡桐的葉片為五角 形、葉片全緣；多倍體毛泡桐的葉片下表皮的氣孔密度比二倍體小，氣孔長寬比二倍體大， 氣孔保衛細胞中的葉綠體數比二倍體毛泡桐多近一倍；j.毛泡桐植株多倍性的染色體數鑒定四倍體毛泡桐的根尖染色體數是2n-80, 二倍體毛泡桐的根尖染色體數是2n^40;k毛泡桐植株多倍性的流式細胞儀分析鑒定將葉片制取細胞核懸浮液后，經含有RNase的碘化丙啶染色處理和溫育30min后，置于 流式細胞儀下分析，四倍體毛泡桐的DNA熒光值在213.0 228.0，是二倍體毛泡桐114.0的 近2倍；l.開花期毛泡桐植株多倍性鑒定取開花期毛泡桐的花朵，測定花朵長度、花萼長寬、花絲長度、花藥長寬、花柱長及子 房長度和直徑，四倍體毛泡桐的花器明顯比二倍體毛泡桐的大，四倍體毛泡桐的花長為9.73 士0.55cm，二倍體毛泡桐花長為7.13土0.12cm:其中花絲長度(3.37士0.48cm : 1.80土0.02cm)、 花藥寬度(0.22土0.01cm : O.ll土O.Olcm)、子房長度(1.10土0.08cm : 0.62土0.01cm)和直徑 (0.82土0.02cm : 0.41土0.02cm)等四倍體毛泡桐的值接近二倍體的2倍。
全文摘要
本發明提出了以胎座為外植體的離體培養和秋水仙素處理結合選育四倍體毛泡桐的方法。它包括a.選擇親本；b.以胎座為最佳外植體；c.胎座愈傷組織誘導；d.胎座愈傷組織加倍處理；e.處理后愈傷組織恢復培養；f.愈傷組織分化培養；g.芽苗生根培養；h.組培苗的移栽；i.毛泡桐植株多倍性的形態學鑒定；j.毛泡桐植株多倍性的染色體數鑒定；k.毛泡桐植株多倍性的流式細胞儀分析鑒定；l.開花期毛泡桐植株多倍性鑒定等十二個步驟。與其他多倍體毛泡桐的成年植株比較，四倍體毛泡桐具有花大、葉厚、不結實等與二倍體毛泡桐明顯不同的特點，具有很好的觀賞價值和生長優勢。該技術不僅可直接應用于選育毛泡桐新品種，也為其它樹木多倍體育種打下良好的基礎。
文檔編號A01G31/00GK101322474SQ20081004849
公開日2008年12月17日 申請日期2008年7月24日 優先權日2008年7月24日
發明者何玉池, 唐志強, 宋兆建, 蔡得田, 陳冬玲 申請人:湖北大學