專利名稱：青蒿多倍體誘導及其栽培方法
技術領域：
本發明涉及一種植物的栽培技術，具體地說，是涉及一種青蒿的栽培方法。
背景技術：
中藥用青蒿為菊科植物黃花蒿(ArtemisiaannuaL.)，具有清熱截瘧、驅風止癢的功效，用于傷暑、瘧疾、潮熱、小兒驚風、熱瀉、惡瘡疥癬等。“青蒿素”是從中藥青蒿中分離出的抗瘧有效單體，是與已知抗瘧藥完全不同的新型化合物，被世界衛生組織稱為世界上唯一有效的瘧疾治療藥物，它不僅是繼氯喹、乙氨嘧啶、伯喹和磺胺后最佳的抗瘧特效藥，并且是所用抗藥中起效最快、效果最好、毒性最低的藥物。
目前藥用青蒿素主要來自植物提取物，種子繁殖。田間栽培是目前獲得青蒿植物的主要途徑，但在天然植物中，青蒿素含量普遍偏低，且不穩定，又因受地理環境采集時期、采集部位、氣溫和施肥等因素的影響，品質不易控制，青蒿素的加工和提取環節較多，費時費力，同時大量采集自然資源，必然會破壞環境和生態平衡，導致資源枯竭。長期以來，世界各國都在加緊開展青蒿素及其衍生物的開發研究。
目前生產提供青蒿原料的主要途徑有自然環境下大田栽培、利用組織培養、細胞培養等方法培養青蒿，其中種子繁殖田間栽培是獲得青蒿植物的主要途徑。是但這些方法青蒿素普遍含量低，且不穩定。培育出含量高且穩定的新品種已成為各國科學家面臨的研究課題。
發明內容
本發明的目的在于提供青蒿多倍體誘導及擴大栽培方法，其采用愈傷組織誘導的多倍體進行擴大繁殖栽培，此方法可以培育出含量高且穩定的新品種，可以提高青蒿素含量及加快生活周期。
為達到目的，本發明的實施方案為一種青蒿多倍體誘導及其栽培方法，其特征在于包括以下步驟(1)取青蒿嫩葉，用0.1％升汞和75％的酒清消毒，接種于MS誘導培養基中，培養條件為溫度為20～30℃，光照8～20小時，濕度為75％～95％；(2)將愈傷組織浸漬于已過濾滅菌的秋水仙堿溶液中，藥液濃度為2500～10000mg/L，處理時間為12～50h，處理完后用無菌水沖洗3次，轉移到不含秋水仙堿的新鮮MS誘導培養基上，暗培養6天，弱光培養6天，然后轉移到MS+6-BAlmg/L+IAA0.1mg/L分化培養基上進行光照培養，培養50天后進行多倍體鑒定，確定其為四倍體青蒿；(3)將具有四倍體特征的青蒿幼苗莖尖轉入增殖培養基中分化出四倍體無菌苗；(4)待苗長到4～6cm時，分成單株，接種于生根培養基上；待根長到1～2cm時開始煉苗，打開瓶蓋，置于室溫下2～4天，取出小菌，洗根部培養基，栽入紅工與腐殖土(2∶1)中，澆透水，先用塑料膜蓋3-6天；(5)將在塑料膜蓋3-6天的青蒿，苗移栽至大田，移栽后定期澆水，進行管理。
步驟(1)、(2)中，所述MS誘導培養基為MS+NAA2mg/L+KT0.1mg/L。
步驟(2)中，所述多倍體鑒定的方法為于上午9-10時采集變異株莖尖，0.002mol/L 8-羥基喹啉溶液預處理3h，再用卡諾固定液化4℃條件下固定2～24h，用1mol的鹽酸60℃條件下解離12min，蒸留水清洗5～6次，用卡寶品紅染色15min后壓片，以細胞分裂相并對染色體計數，染色體數目均為2n＝4x＝36，確定其為四倍體植物。
步驟(3)中，所述增殖培養基為MS+6-BA2～4mg/L+NAA0.1～0.5mg/L。
步驟(4)，所述生根培養基為MS+2，4-D1～2mg/L+KT0.1～0.2mg/L。
本發明是將青蒿幼嫩葉作為外植體，經常規殺菌處理后，用無菌濾紙吸干表面水，然后用培養基對外植體愈傷組織進行誘導，將誘導出的愈傷組織進行用秋水仙堿進行多倍體的誘變，誘變后進行分化培養，進行多倍體的鑒定，對多倍體植時進行生根培養。本發明克服了自然狀態下青蒿素普遍含量低，且不穩定，受地理環境采集時期，采集部位、氣溫和施肥等因素的影響，品質不易控制境等因素的限制，可以培育出含量高且穩定的新品種，可以提高青蒿素含量及加快生活周期。
具體實施方法(1)愈傷組織誘導于晴天采高青蒿素含量的青蒿嫩葉，用0.1％的升汞消毒10min，然后用75％酒精消毒30s，無菌水沖洗7次，剪碎葉片，接種于MS+NAA2mg/L+KT0.1mgg/培養基上進行誘導。
(2)多倍體誘導將誘導出的愈傷組織浸漬在已過濾滅菌的秋水仙堿溶液中，藥液濃度為2500mg/L～10000mg/L，處理時間20～50h，處理后用無菌水沖洗3次，轉移至不含秋水仙堿的新鮮培養基上，暗培養6天，再弱光培養6天，然后轉移到MS+6-BA1mg/L+IAA0.1mg/L分化培養基上進行光照培養，50天后進行多倍體鑒定。
(3)多倍體的鑒定于上午10時采集變異株莖尖，0.002mol/Lr8-羥基喹啉溶液預處理3h，再用卡諾固定液化4℃條件下固定2～24h，用1mol的鹽酸60℃條件下解離12min，蒸留水清洗5～6次，用卡寶品紅染色15min后壓片，以細胞分裂相并對染色體計數，染色體數目均為2n＝4x＝36，確定其為四倍體植物。
(4)多倍體苗的培養將具有四倍體特征幼苗莖尖轉入增殖培養基中，均能分化出四體無菌苗，增殖培養基為MS+6-BA2～4mg/L+NAA0.1～0.5mg/L。
(5)生根培養及煉苗進行生根培養及煉苗 待苗長至4～6cm時，分成單株，除去基部的愈傷組織，接種于MS+2，4-D1～2mg/L+KT0.1～0.2mg/L進行生根培養，待根長到1～2cm時開始煉苗，打開瓶蓋，置于室溫下2～4天，取出小菌，洗根部培養基，栽入紅工與腐殖土(2∶1)中，澆透水，先用塑料膜蓋5天，(6)移栽大田將塑料膜中生長5天的苗移至大田，移栽后定期澆水時行田間管里。
權利要求
1.一種青蒿多倍體誘導及其栽培方法，其特征在于，包括以下步驟(1)取青蒿嫩葉，用0.1％升汞和75％的酒清消毒，接種于MS誘導培養基中，培養條件為溫度為20～30℃，光照8～20小時，濕度為75％～95％；(2)將愈傷組織浸漬于已過濾滅菌的秋水仙堿溶液中，藥液濃度為2500～10000mg/L，處理時間為12～50h，處理完后用無菌水沖洗3次，轉移到不含秋水仙堿的新鮮MS誘導培養基上，暗培養6天，弱光培養6天，然后轉移到MS+6-BA1mg/L+IAA0.1mg/L分化培養基上進行光照培養，培養50天后進行多倍體鑒定，確定其為四倍體青蒿；(3)將具有四倍體特征的青蒿幼苗莖尖轉入增殖培養基中分化出四倍體無菌苗；(4)待苗長到4～6cm時，分成單株，接種于生根培養基上；待根長到1～2cm時開始煉苗，打開瓶蓋，置于室溫下2～4天，取出小菌，洗根部培養基，栽入紅工與腐殖土(2∶1)中，澆透水，先用塑料膜蓋3-6天；(5)將在塑料膜蓋3-6天的青蒿，苗移栽至大田，移栽后定期澆水，進行管理。
2.根據權利要求1所述的青蒿多倍體誘導及其栽培方法，其特征在于，步驟(1)、(2)中，所述MS誘導培養基為MS+NAA2mg/L+KT0.1mg/L。
3.根據權利要求1所述的青蒿多倍體誘導及其栽培方法，其特征在于，步驟(3)中，所述增殖培養基為MS+6-BA2～4mg/L+NAA0.1～0.5mg/L。
4.根據權利要求1所述的青蒿多倍體誘導及其栽培方法，其特征在于，步驟(4)，所述生根培養基為MS+2，4-D1～2mg/L+KT0.1～0.2mg/L。
5.根據權利要求1所述的青蒿多倍體誘導及其栽培方法，其特征在于，步驟(2)中，所述多倍體鑒定的方法為于上午10時采集變異株莖尖，0.002mol/Lr 8-羥基喹啉溶液預處理3h，再用卡諾固定液化4℃條件下固定2～24h，用1mol的鹽酸60℃條件下解離12min，蒸留水清洗5～6次，用卡寶品紅染色15min后壓片，以細胞分裂相并對染色體計數，染色體數目均為2n＝4x＝36，確定其為四倍體植物。
全文摘要
一種青蒿多倍體誘導栽培方法，其主要步驟是將高青蒿素含量的青蒿幼嫩葉作為外植體，經常規殺菌處理后，用無菌濾紙吸干表面水，然后用培養基對外植體愈傷組織進行誘導，將誘導出的愈傷組織進行用秋水仙堿進行多倍體的誘變，誘變后進行分化培養，進行多倍體的鑒定，對多倍體植時進行生根培養。本發明克服了自然狀態下青蒿素普遍含量低，且不穩定，受地理環境采集時期，采集部位、氣溫和施肥等因素的影響，品質不易控制境等因素的限制，可以培育出含量高且穩定的新品種，可以提高青蒿素含量及加快生活周期。
文檔編號C12N5/04GK101015275SQ200710034499
公開日2007年8月15日 申請日期2007年3月7日 優先權日2007年3月7日
發明者曹庸, 姚茂君, 于華中, 陳學香, 雷勇, 李偉 申請人:曹庸