具有改變的生長特性的植物及其生產方法

專利名稱：具有改變的生長特性的植物及其生產方法
技術領域：
本申請涉及一種改變植物的生長特性的方法。更為具體地說，本發明涉及通過改變植物中編碼TAD蛋白的核酸序列的表達和/或TAD蛋白的活性來增加產量。本發明還涉及具有編碼TAD蛋白核酸序列表達的改變和/或TAD蛋白活性改變的植物，該植物相對于相應的野生型植物具有增加的產量。
背景技術：
AAA蛋白家族(ATPases Associated with various cellularActivities，Kunau等人，Biochimie 75，209-224，1993)代表了一大組共有大約230個氨基酸的高度保守的ATP結合結構域的蛋白，表現出ATPase活性(Neuwald等人，Genome Research 9，27-43，1999；Vale，J.Cell Biol.150，F13-F19，2000)。AAA蛋白分布廣泛，且已經在古細菌(Archaea)、真細菌(Eubacteria)和所有的真核界中被鑒定。AAA結構域是蛋白功能所必需的，以六聚體環組織，在ATP水解時發生構象改變。這種依賴于ATP水解的構象改變給結合蛋白質施加了壓力，這一機械活動使相關蛋白打開折疊、蛋白-蛋白分離等等。結果，AAA蛋白在不同的細胞過程中發揮重要作用，包括細胞周期、細胞器合成、線粒體功能、囊泡運輸、蛋白折疊、細胞骨架的調節和細胞內運動。因此，AAA蛋白可能代表了許多種類的機械酶(mechanoenzymes)，涉及在許多不同生物環境中利用實質上類似的構象改變的獨特的方式，但是與其目標蛋白相互作用的基礎仍然是需要思考的問題(Vale，2000)。到目前為止，大多的研究努力集中于解析AAA ATPases的分子結構和功能，而人們對它們在宏觀水平的功能，例如植物生長或產量，一無所知。
基于不斷增長的世界人口，提高農業效率和增加植物園藝學的多樣性仍然是農業研究的一個主要目標。農作物和園藝提高的傳統方式采用選擇性育種技術來識別具有需要的特性的植物。然而，這種選擇性育種技術具有幾個缺點，即，這些技術通常是勞動密集型的，并且導致經常含有異質性遺傳組分的植物，這導致所需的特性不能總是從親本植物傳給下代。分子生物學的進步已經允許人類操縱動物和植物的生殖質。植物的遺傳工程學使分離和操縱遺傳材料(通常以DNA或RNA的形式)以及隨后將遺傳材料導入植物成為可能。這種技術已經導致具有多種改良的經濟學、農藝學或園藝學性質的植物的產生。一種具有特別經濟利益的特性為較高的產量。
發明詳述發明人驚奇地發現改變植物中編碼來源于TOB3樣蛋白的ATPase結構域(此后命名為TOB3 ATPase結構域，TAD)的核酸序列的表達導致相對于相應的野生型植物具有增加的產量。
因此，根據本發明的第一個具體實施方式
，提供了與相應的野生型植物相比，增加植物的產量的方法，包括改變植物中分離的編碼TAD蛋白或其同源物、衍生物或活性片段的核酸序列的表達和/或改變植物中TAD蛋白、其同源物、衍生物或活性片段的活性。
這里所定義的術語TAD編碼核酸/基因指任意的編碼來源于TOB3樣蛋白的ATPase結構域的核酸或其互補序列。該核酸可以從任何來源獲得(直接或間接(如果隨后進行修飾))，只要該序列在植物中表達時，導致TAD核酸/基因表達的改變。該核酸可以從微生物來源分離，例如細菌、古細菌(archaea)、酵母或真菌，或來自植物、藻類或動物來源。與其原始的形式相比，通過精密的人工操作，該核酸的組成和/或基因組環境可以充分地改變，該核酸分子優選同源性的核酸分子，即結構和/或功能相關的核酸分子，優選來自植物，無論來自相同或不同的植物品種。該核酸分子可以從雙子葉植物中分離，優選來自茄科(Solanaceae)，進一步優選來自煙草(Nicotiana tabacum)，更加優選該核酸是SEQ ID NO1所代表的核酸或其一部分，或能夠與其雜交的核酸，該雜交分子編碼具有TAD(ATP結合和/或ATP水解)活性的蛋白質，即與SEQ ID NO1具有類似的生物學活性；或該核酸編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或編碼其同源物、衍生物或活性片段。術語TAD編碼核酸/基因也包括根據遺傳密碼的簡并性編碼TAD的核酸的變異體；編碼TAD的核酸的等位基因變異體；編碼TAD的核酸的不同的剪接變異體及被一個或多個插入序列中斷的變異體。
這里所定義的術語TAD指含有來源于TOB3樣蛋白的ATPase結構域的蛋白。TAD優選來自煙草，更加優選TAD蛋白是由SEQ ID NO2所示的蛋白，或其同源物、衍生物或活性片段，該同源物、衍生物或活性片段與SEQ ID NO2具有相似的生物活性。檢測ATP結合或檢測ATPase活性的方法在現有技術中廣為人知。
根據本發明的方法可以方便地采用SEQ ID NO1所代表的序列的一部分進行，或通過采用與SEQ ID NO1雜交(優選在嚴格條件下)的序列進行，該雜交序列與SEQ ID NO1發揮同樣的生物學功能(即編碼具有TAD活性的蛋白)，或通過采用編碼SEQ ID NO 2的序列的同源物、衍生物或其活性片段的核酸進行。
SEQ ID NO 2的同源物可以在多種原核和真核生物體中找到。然而最接近的同源物通常在植物界中發現。合適的SEQ ID NO2的同源物包括其它在蛋白中出現的TAD結構域，例如在GenBank中登錄號NP_565435、NP_195376、AAL87170、BAD08048、NP_186956、BAD07862、NP_197195或PIR登錄號A84563或T51548中所示的。
搜索和識別TAD同源物的方法完全在本領域熟練技術人員所掌握的技術范圍內。這種方法包括用計算機可讀形式的SEQ ID NO 1或2代表的序列與可以在公共數據庫中得到的序列進行對比，例如MIPS(http//mips.gsf.de/)、GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)或EMBL核酸序列數據庫(http//www.ebi.ac.uk/embl/index.html)，采用現有技術中已知的序列比對或比較的運算法則，例如，GAP(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48，443-453(1970))、BESTFIT(使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics 2，482-489(1981)))、BLAST(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.& Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215，403-410(1990))、FASTA和TFASTA(W.R.Pearson和D.J.Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，2444-2448(1988))。公眾可以通過美國國立生物技術信息中心獲得進行BLAST分析的軟件。
上述為了計算序列同源性的分析可以采用全長查詢序列或這種序列的一定區域，例如采用保守結構域。識別TAD家族成員(如下定義)或確定TAD和同源物(如下定義)的序列一致性的百分比也可以通過采用這些保守序列進行。對蛋白序列中這種結構域的識別，也完全在本領域技術人員的技術領域內，并涉及本發明采用的計算機可讀形式的核酸、比對軟件程序的應用和蛋白質結構域、保守基序和盒的公開信息的應用。綜合搜索可以采用INTERPRO數據庫(Mulder等，(2003)Nucl.Acids Res.31，315-318，http//www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)進行，該數據庫將關于蛋白質家族、結構域和功能位點的幾個數據庫結合起來，例如PRODOM(Servant等人，(2002)Briefings in Bioinformatics 3，246-251，http//prodes.toulouse.inra.fr/prodom/2002.1/html/home.php)、PIR(Huang等人，(2003)Nucl.Acids Res.31，390-392，http//pir.georgetown.edu/)或Pfam(Bateman等人，(2002)Nucl.Acids Res.30，276-280，http//pfam.wustl.edu/)數據庫。為基序搜索而設計的序列分析程序可以用于識別上述的保守片段、區域和結構域。為這一目標的合適的計算機程序包括，例如MEME(Bailey和Elkan(1994)Proceedings of the Second InternationalConference on Intelligent Systems for Molecular Biology，pp.28-36，AAAI Press，Menlo Park，California，http//meme.sdsc.edu/meme/website/intro.html)。
術語TAD包括SEQ ID NO 2代表的蛋白的蛋白同源物，TAD蛋白的“同源物”包括相對于未改變的蛋白具有氨基酸取代、缺失和/或插入的肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶，且具有與它們衍生自的未改變蛋白類似的生物學和功能活性。為生產這種同源物，蛋白質的氨基酸可以被其他具有類似性質(例如類似的疏水性、親水性、抗原性、形成或打破α-螺旋結構或β-片層結構的傾向性)的氨基酸替代。現有技術中熟知保守替代表(例如參見Creighton(1984)Proteins，W.H.Freeman and Company)。
當采用例如GAP的比對程序，缺口罰分為10和延伸罰分(extendpenalty)為0.5以及BLOSUM62矩陣，可用于本發明的方法的同源物在其與SEQ ID NO 2相應的蛋白質序列的部分中，與SEQ ID NO 2具有至少70％的序列一致性。通常同源物與SEQ ID NO 2具有至少80％的序列一致性或相似性，優選至少85％的序列一致性或相似性，進一步優選與SEQ ID NO 2具有至少90％的序列一致性或相似性，最優選與SEQ ID NO 2具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性或相似性。相似性的百分比也可以采用例如GAP的比對程序計算。
另外，可用于本發明的方法的同源物也可以定義為具有ATP結合活性和/或ATPase活性、且包括22個連續氨基酸殘基的序列，該序列與SEQ ID NO 2中的相應序列具有至少90％的一致性。
同源物蛋白可以被分組為“蛋白家族”，一個蛋白家族可以采用例如Clustal W的程序通過功能和序列相似性分析而定義。由ClustalW程序產生的SEQ ID NO 2的同源性蛋白的鄰近關系樹給出了它們的結構和祖先關系的良好的概括。這些家族成員可以方便地用于本發明的方法中。
兩種特殊類型的同源物，直向同系物(orthologous)和平行進化同源物(paralogues)是用來描述基因的祖先關系的進化概念。術語“平行進化同源物”涉及來自物種的基因組內的一個或多個基因副本的同源性基因。術語直向同系物涉及在不同的有機體中根據祖先關系確定的同源性基因。這里采用的術語“同源物”也包括了可用于本發明的方法的蛋白的平行進化同源物和直向同系物。直向同系物基因可以通過用感興趣的目的基因查詢一個或多個數據庫而識別，采用諸如BLAST的程序，從搜索中得到的最高級別的目標基因接著再進行BLAST分析，只有那些與查詢基因再次匹配的目標基因被保留為真正的直向同系物基因。例如，為了找到擬南芥(Arabidopsis thaliana)基因的水稻直向同系物(orthologues)，可以對水稻數據庫進行BLASTN或TBLASTX分析，(例如(但并不限于)在NCBI網站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)可獲得的水稻(Oryza sativa)Nipponbare數據庫，或水稻的基因組序列(栽培種indica或japonica)。下一步，得到的水稻序列被用來用擬南芥數據庫進行反向BLAST分析。當得到的序列用ClustalW分析并在鄰近關系樹狀圖中顯示時，結果可以被進一步精確。該方法可以用來識別從其它許多不同物種得到的直向同系物。
蛋白質的“取代變異體”指那些氨基酸序列中至少一個殘基被去除且一個不同的殘基插入該位置的變異體。氨基酸的取代通常為單個殘基，但可以根據多肽的功能限制而成簇取代。氨基酸取代優選包括保守氨基酸的取代。蛋白質的“插入變異體”為那些在所述蛋白質的預先確定的位置插入了一個或多個氨基酸殘基的蛋白質。插入可以包括氨基端和/或羧基端的融合以及序列內單個或多個氨基酸的插入。通常在氨基酸序列內的插入比氨基或羧基端的融合小1到10個殘基的級別。氨基端或羧基端融合蛋白或肽的例子包括在酵母雙雜交系統采用的轉錄活化劑的結合結構域或活性結構域、噬菌體包膜蛋白，(組氨酸)6-標簽，谷胱甘肽S轉移酶標簽，蛋白A，麥芽糖結合蛋白，二氫葉酸還原酶，標簽·100抗原決定簇，c-myc抗原決定簇，FLAG-抗原決定簇，lacZ，CMP(鈣調蛋白(calmodulin)結合肽)，HA抗原決定簇，蛋白C抗原決定簇和VSV抗原決定簇。蛋白的“缺失變異體”以從蛋白中去除一個或多個氨基酸為特征，缺失通常在大約1-20個殘基的范圍內。蛋白的氨基酸變異體可以容易地用現有技術中已知的肽合成技術制成，例如固相肽合成以及類似的技術，或通過重組DNA操作。現有技術中熟知操作DNA序列來產生蛋白的取代、插入或缺失變異體的方法。例如，在DNA中預先確定的位點產生取代突變的技術為本領域技術人員熟知，包括M13誘變，T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH)，QuickChange定點誘變(Stratagene，San Diego，CA)，PCR-介導的定點誘變或其它定點誘變方案。
術語“衍生物”指肽，寡肽，多肽，蛋白和酶，與蛋白的天然形式的氨基酸序列，例如SEQ ID NO2所列的蛋白相比，它們可以含有天然或非天然發生氨基酸殘基的取代、缺失或添加。TAD的“衍生物”包含肽，寡肽，多肽，蛋白和酶，其中可以含有天然產生的改變，糖基化，酰基化或與多肽的天然形式的氨基酸序列相比非天然發生的氨基酸殘基。與其來源的氨基酸序列相比，衍生物也可以包括一個或多個非氨基酸的取代，例如，與氨基酸序列共價或非共價結合并促進其檢測的報告分子或其它配體，以及相對于天然發生蛋白的氨基酸序列的非天然發生的氨基酸殘基。TAD蛋白的“活性片段”包括蛋白質的至少5個鄰近的氨基酸殘基，該殘基保留了與天然發生的蛋白質類似的生物學和/或功能活性。
本發明的方法也可以方便地采用DNA或核酸分子的一部分實施，該部分保留了TAD活性，即與SEQ ID NO2相似的生物學功能。DNA分子的一部分指從原始(較大的)DNA分子得來或制備的DNA片段，當該DNA部分在植物中表達時，使植物具有改變的生長特性。該部分可以包括許多基因，含有或不含另外的調控元件，或可以只包括間隔序列。
本發明也包括能夠與編碼TAD蛋白的核酸分子雜交的核酸分子，本發明的方法也可以采用這些核酸分子施行。這里定義的術語“雜交”是同源性互補核苷酸序列充分地相互退火的過程。雜交過程可以完全在溶液中進行，即，互補核酸都在溶液中。依賴于這一過程的分子生物學工具包括聚合酶鏈反應(PCR；以及所有以此為基礎的方法)、差減雜交、隨機引物延伸、核酸酶S 1作圖、引物延伸、反轉錄、cDNA合成、RNAs差異顯示、以及DNA序列確定。雜交過程的發生也可以其中一個互補核酸固定于基質，例如磁珠、瓊脂糖凝膠或任何其它樹脂。依賴于這一過程的分子生物學工具包括分離poly(A+)mRNA。此外，雜交過程的發生可以其中一個互補核酸固定于固體支持物，例如硝酸纖維素或尼龍膜，或者用如光刻法的方式固定于例如硅玻璃支持物(后者已知為核酸陣列或微陣列或核酸芯片)。依賴于這一過程的分子生物學工具包括RNA和DNA凝膠印跡分析、菌落雜交、蝕斑雜交、原位雜交和微陣列雜交。為了允許雜交的發生，核酸分子通常被加熱或用化學方法變性從而由雙鏈熔解為兩條單鏈和/或從單鏈中去除發卡結構或其它的二級結構。例如溫度、鹽濃度和雜交緩沖液成分的條件影響著雜交的嚴格性。
對于需要較高的選擇性的應用，通常需要采用相對嚴格的條件來形成雜交，例如，將選擇較低的鹽濃度和/或較高的溫度，如由大約0.02M到大約0.15M NaCl在大約50℃到大約70℃提供的。因此雜交的高度嚴格性條件包括較高的溫度和/或低鹽濃度(包括NaCl和檸檬酸鈉的鹽)，但雜交緩沖液中甲酰胺的存在和/或降低雜交緩沖液中例如SDS(十二烷基硫酸鈉)的化合物的濃度和/或從雜交緩沖液中排除硫酸葡聚糖或聚乙二醇(提高分子擁擠度)等化合物也可以影響雜交的嚴格性。特別優選足夠低的雜交嚴格度條件來分離與本發明先前定義的DNA序列同源的核酸。導致同源性的因素包括等位性、遺傳密碼簡并性和優選密碼子應用的不同等。
在核酸雜交試驗，例如Southern和Northern雜交的情形下，“嚴格雜交條件”和“嚴格雜交洗滌條件”取決于序列，在不同的環境參數下也不同。例如，較長的序列在較高的溫度下特異性地雜交。Tm是在預定的離子強度和pH下，50％的目標序列與完全匹配的探針雜交的溫度。特異性通常是雜交后洗滌的函數，這種洗滌的關鍵因素包括最終洗滌溶液的離子強度和溫度。通常，選擇的嚴格條件比在定義的離子強度和pH下特異性序列的熱熔點Tm低大約50℃。Tm是在定義的離子強度和pH下，50％的目標序列與完全匹配的探針雜交的溫度。Tm取決于溶液條件和探針的堿基組成，可以用下列等式計算Tm＝79.8℃+(18.5xlog[Na+])+(58.4℃x％[G+C])-(820x(雙鏈中的#bp)-1)-(0.5x％甲酰胺)更加優選的嚴格條件為當溫度低于Tm20℃時，最優選的嚴格條件為當溫度低于Tm10℃時。也可以采用一些已知技術的任意一種來控制非特異性結合，例如用含有蛋白質的溶液封閉膜，向雜交緩沖液中加入異源性RNA、DNA，以及SDS，以及用Rnase處理。洗滌條件通常在雜交嚴格度條件或低于雜交嚴格度條件實行。通常，核酸雜交分析的適宜嚴格度條件或基因擴增檢測的程序如上所述，可選擇嚴格度更高或更低的條件。
為了確定嚴格度的水平，可以方便地參考Sambrook等人(2001)分子克隆實驗室手冊，第3版，冷泉港實驗室出版社，CSH，紐約，或參考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)。低嚴格度條件的例子為4-6xSSC/0.1-0.5％w/vSDS，37-45℃，2-3小時。根據雜交中核酸的來源和濃度，可以采用其它的嚴格度條件，例如中等嚴格度條件。中等嚴格度條件的例子包括1-4xSSC/0.25％w/vSDS，≥45℃，2-3小時。高嚴格度條件的例子包括0.1-1xSSC/0.1％w/vSDS，60℃，1-3小時。熟練技術人員知道雜交及沖洗期間可以改變的多種參數，以及維持或改變嚴格度條件的參數。例如，另一嚴格雜交條件是在4xSSC，65°雜交，然后在0.1xSSC中，65℃洗滌大約1小時。另外，可效仿的嚴格雜交條件為在50％的甲酰胺，4xSSC中，42℃。另一嚴格條件的例子包括在62℃，6xSSC、0.05xBLOTTO中雜交和在2xSSC、0.1％w/v SDS中，62℃洗滌。
本發明的方法也可應用編碼TAD蛋白的核酸分子的可變剪接變異體實行。這里應用的術語“可變剪接變異體”包括選擇的內含子和/或外顯子已經被切除、替代或加入的核酸序列的變異體。這種變異體可以是其中的蛋白的活性保持不受影響的變異體，可以通過選擇性地保留蛋白的功能片段而實現。這種剪接變異體可以在自然界中發現或人工制造。現有技術中眾所周知制造該剪接變異體的方法。因此本發明也包括改變植物的生長特性，特別是提高產量的方法，包括改變植物中編碼TAD的核酸分子的可變剪接變異體的表達和/或改變由可變剪接變異體編碼的TAD的活性和/或水平。該剪接變異體優選SEQ IDNO1所示序列的剪接變異體。
本發明的方法也可方便地采用編碼TAD的核酸分子的等位基因變異體施行，優選SEQ ID NO1所示的序列的等位基因變異體。自然界中存在等位基因變異體，本發明的方法包括使用這些天然等位基因。等位基因變異體也進一步定義為包括單核苷酸多態性(SNPs)，以及小插入/缺失多態性(INDELs；INDELs的大小通常小于100bp)。在多數有機體的自然發生的多態系中，SNPs和INDELs組成了最大一組的序列變異體。它們有助于基因作圖和發現基因和基因功能。它們另外還有助于識別基因位點，例如植物基因，涉及生長率、植物大小和植物產量、植物活力、抗病性、應激耐受等等的確定過程。現在可以獲得識別SNPs和/或INDELs的許多技術，包括(i)PCR，然后進行高效液相變性色譜(DHPLC；例如Cho等人(1999)Nature Genet.23，203-207)；(ii)連續變性毛細管電泳(CDCE)與高保真PCR結合(例如，Li-Sucholeiki等人(1999)Electrophoresis 20，1224-1232)；(iii)變性梯度凝膠電泳(Fischer和Lerman(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，1579-1583)；(iv)基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜分析(MALDI-TOF MS；例如，Ross等人(2000)Biotechniques 29，620-629)；(v)實時熒光監測PCR分析(Tapp等人，(2000)Biotechniques 28，732-738)；(vi)AcryditeTM凝膠技術(Kenney等人，(1998)Biotechniques 25，516-521)；(vii)循環雙脫氧指紋識別(CddF；Langemeier等人，(1994)Biotechniques 17，484-490)；(viii)單鏈構象多態性(SSCP)分析(Vidal-Puig和Moller(1994)Biotechniques 17，490-496)以及(ix)迷你測序引物延伸反應(Syvanen(1999)Hum.Mutat.13，1-10)。基因組靶向誘導位點損傷技術(TILLING；McCallum等人，(2000)Nat.Biotechnol.18，455-457；Plant Physiol.123，439-442)是上述(i)的變體，也可以用于迅速地在例如表現出感興趣表型的化學誘變的植物個體中識別改變的基因。
在特定的常規育種程序中，例如在標志物輔助育種中，上述的等位基因變異體的運用也包含在本發明內；這可以是它們在本發明的方法中另外的應用。這種育種程序有時要求通過對植物進行誘變處理向植物中引入等位基因變異體。一種合適的誘變方法為EMS誘變，接著通過例如PCR的方法來識別等位基因變異體，之后為選擇步驟，來選擇討論序列[命名蛋白]的更好的等位基因變異體，該變異體可以使植物中生長特性發生改變。選擇通常通過監控含有不同的所討論序列的等位基因變異體的植物的生長表現進行，例如，SEQ ID NO1的不同等位基因變異體。監控生長表現可以在溫室或田野中進行。另外可選擇的步驟包括將其中識別了優良等位基因變異體的植物與其它植物雜交，這可以被用于將感興趣表型特性組合起來等等。因此，由于TAD基因中的突變可以天然發生，它們可以構成選擇表現出高產量的植物的基礎。
本發明的方法也可以通過向植物中至少導入染色體的一部分(自然的或人工的)(例如細菌人工染色體(BAC))來施行，該染色體含有編碼TAD(例如SEQ ID NO1)的至少一種基因/核酸，優選與來自同一物種或來自同一基因家族的一個或多個相關基因，和/或編碼TAD表達和/或活性的調控蛋白的核酸分子同時導入。因此，本發明也包括了一種通過向植物中導入含有至少一個編碼TAD的基因/核酸的染色體的一部分來改變植物的生長特性，特別是提高產量的方法，該編碼TAD的基因/核酸在種子優先啟動子的控制下，且人工染色體也優選包括來自同一物種的一個或多個相關基因，和/或編碼TAD表達和/或活性的調控蛋白的核酸序列。
根據本發明的一個優選方面，設想與相應的野生型植物對比使核酸過表達(或表達提高)，提高或降低編碼TAD蛋白的核酸的表達(或調節表達)包括在整個生物體或在特定的細胞或組織中改變表達。可以通過例如化學手段和/或重組手段來實現改變基因的表達。調節TAD基因的表達可以直接實現(即通過調節所述TAD編碼基因本身的表達)。在直接方法中，調節的表達可以由改變內源性TAD基因的表達而產生和/或可以由改變預先導入植物的TAD編碼核酸的表達而產生。另外或可選地，上述的表達的調節可以以間接方式達到，例如作為降低或增加調控TAD基因表達的因子的水平和/或活性的結果。改變的表達理解為當與相應的野生型植物的相應的TAD蛋白的表達對比時的改變。
可以方便地通過化學手段改變編碼TAD蛋白核酸的表達和/或改變TAD蛋白本身的水平和/或活性，即通過外源性應用一種或多種能夠改變TAD基因(該基因可以是一種內源性基因或導入植物的轉基因)的表達的化合物或元件。術語“外源性應用”在其廣義的含義包括用合適的化合物或元件接觸或給予細胞、組織、器官或生物體。該化合物可以以適合植物攝入的方式外源性地應用于植物(例如通過施用到土壤中通過根來吸收，或直接施用于葉子，如通過噴霧)。適合外源性應用的化合物或元件包括編碼TAD的核酸或與其雜交的核酸。另外或可選地，用基因的相互作用蛋白或用抑制劑或活化劑接觸或給予細胞、組織、器官或生物體提供了調控編碼TAD的核酸的表達的另一外源性方式。編碼TAD的核酸的表達調控也可以作為直接或間接活化或滅活TAD蛋白的因子的水平改變的結果而實現。
而且，植物、種子或其它植物材料可以用誘變物質進行處理。誘導突變的化學物質包括N-亞硝基-N-乙脲、吖丙啶、乙基甲烷磺酸酯和二乙基硫酸酯。作為選擇，離子放射，例如X線或γ線也可以同樣良好地使用。引入突變和檢測突變效果的方法(例如改變的基因表達和/或改變的蛋白活性)是現有技術中已知的。誘變包括利用化學突變劑，以及物理突變劑，例如放射。TAD蛋白的任何特性均可以通過誘變而改變，例如這些突變可以是TAD編碼基因調控改變的原因，導致基因預期的表達水平或表達模式。特別是，這些突變可以導致TAD主要限于種子的過表達。可選地和/或另外地可以調節蛋白的活性或底物特異性，或可以調節對輔因子的親和性。根據本發明的一個優選方面，所述的誘變導致TAD蛋白在植物種子中表達和/或活性和/或水平的增加。
另外或作為選擇，根據本發明的一個優選實施方式，調節編碼TAD蛋白的核酸的表達和/或改變TAD蛋白本身的水平和/或活性可以通過重組手段實現。這種重組手段可以包括直接或間接途徑來調節核酸的表達。
例如，一種間接途徑可以包括向植物中導入一種能夠調節目的蛋白(TAD蛋白)水平和/或活性和/或能夠改變目的基因(編碼TAD蛋白的基因)表達的核酸。這些能被導入植物中的核酸的例子包括編碼與TAD基因啟動子結合或與TAD蛋白相互作用的轉錄因子、活化劑、抑制劑或其它配體的核酸。檢測這些類型的相互作用的方法和分離編碼這種相互作用物的核酸的方法包括酵母單雜交或酵母雙雜交篩查等。TAD基因或TAD蛋白可以是野生型，即天然或內源性核酸或多肽。可選地，它可以是來自同一或另一物種的核酸，例如通過轉化將該基因作為轉基因導入。該轉基因可以相對于其最初的形式在組成和/或基因組環境上通過精密的人工操作充分地改變。還包括一種調節TAD基因表達的間接途徑，即抑制或刺激調控序列，或提供驅動編碼TAD的天然基因或編碼TAD的轉基因表達的調控序列。這種調控序列可以被導入植物，例如，被導入植物的調控序列可以是能夠驅動內源性TAD基因表達的啟動子。
一種調節TAD基因表達的直接和優選的途徑包括向植物中導入編碼TAD蛋白或其同源物、衍生物或其活性片段的核酸分子。該核酸可以被導入植物，例如通過轉化。
一種更加優選的途徑包括向植物中導入SEQ ID NO 1所示的TAD基因。最優選的途徑包括向植物中導入以有義方向與種子優先啟動子偶聯的TAD編碼基因。
現有技術中已經有許多文件記載了獲得提高或增加的基因表達或基因產物的方法，包括通過合適的啟動子驅動的過表達以及轉錄增強子或翻譯增強子的應用。這里采用的術語“過表達”一詞表示相對于原初野生型表達水平增加的任意形式的表達。相對于它所可操作地連接的啟動子，優選引入植物的核酸和/或在植物中過表達的核酸為有義方向。過表達的核酸優選編碼TAD蛋白，更加優選植物來源的TAD蛋白，該編碼TAD蛋白的核酸分子更加優選來自雙子葉植物，優選來自茄科(Solanaceae)，更加優選分離于煙草。該核酸序列最優選SED IDNO1所示的核酸序列或其一部分，或編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或編碼其同源物、衍生物或活性片段。然而，必須注意本發明的應用并非僅限于SEQ ID NO1所示的核酸的應用，也不僅限于編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的核酸分子，而其它編碼SED ID NO2的同源物、衍生物或活性片段的核酸分子或SEQ ID NO1的部分，或與SEQ ID NO1雜交的序列均可應用于本發明的方法中。
根據本發明的另一方面，設想核酸序列表達下降。改變基因的表達(通過直接或間接方法)包括改變基因的轉錄水平。改變轉錄水平可能足夠誘發一定的表型效應，例如通過共抑制機理。這里過表達轉基因的總體效應是，細胞中的與引入的轉基因有同族關系的天然基因編碼的蛋白質具有較小的活性，其它降低表達的例子在現有技術中已經有許多文件說明，包括，例如通過反義技術、共抑制技術、RNAi技術、小干擾RNAs(siRNAs)和微RNA(miRNA)、核酶的應用等等下調表達。因此根據本發明的一個特定方面，提供了改變植物生長特性的方法，包括基于反義轉錄物(與TAD基因片段的mRNA互補)的合成、或基于RNA干擾的技術。本發明的方法可以方便地通過下調編碼TAD的核酸序列來施行。具有改變的生長特性的植物可以通過以有義或反義方向表達編碼TAD的核酸序列而獲得。下調技術是現有技術中眾所周知的。這里采用的術語表達的“基因靜默”或“下調”指降低基因表達的水平和/或活性基因產物的水平和/或基因產物的活性的水平。這種表達的降低可以伴隨著有義方向的編碼序列或其部分的增加等等(如果需要共抑制)。因此，根據本發明的一個方面，可以通過向植物中導入另外拷貝的(全長或部分)宿主植物中已經存在的TAD基因的片段而改變植物的生長。加入的基因將使內源性基因靜默，產生已知為共抑制的現象。
以基因表達靜默為目的的遺傳構建體可以包括編碼TAD的核酸序列，例如相對于啟動子序列的有義和/或反義方向的SEQ ID NO1所示的核酸序列(或其中一個或多個部分)，本發明的方法中也可以利用正向或反向重復形式的內源基因的至少一部分的有義或反義拷貝。植物的生長特性也可以通過向植物中引入SEQ ID NO1等所示的核酸序列的反義形式的至少一部分而改變。應當清楚核酸的局部(一部分)可以達到需要的結果。來自同樣植物物種的相應的基因的反義序列優于來自同樣或其它植物物種的同源性基因的反義序列。
另一個下調基因表達或基因靜默的方法包括采用核酶，如Atkins等人1994(WO94/00012)，Lenee等人1995(WO95/03404)，Lutziger等人2000(WO00/00619)，Prinsen等人1997(WO97/3865)以及Scott等人1997(WO97/38116)所描述的。
基因靜默也可以通過插入誘變而達到(例如，T-DNA插入或轉座子插入)，或通過Angell和Baulcombe 1998(WO98/36083)，Lowe等人1989(WO98/53083)，Lederer等人1999(WO99/15682)或Wang等人1999(WO99/53050)所描述的基因靜默策略。如果內源性基因含有突變，則內源性基因的表達也可以下調，為了得到具有改良的生長特性的植物，這樣的突變基因可以被分離并引入同樣或不同的植物物種。
TAD蛋白的過表達優選首先在植物的種子中實現，更加優選在種子的胚乳中。可選地，過表達在植物的幼苗中實現，本發明的方法的實行可以方便地導致植物具有多種改變的生長特性，這些生長特性包括相對于相應的野生型植物改變的產量或生物量。改變的生長特性優選為改善的生長特性，包括相對于相應的野生型植物增加的產量或生物量。
“產量”指單位面積生產的收獲物的量，術語“增加的產量”包括相對于相應的野生型植物的生物量而言植物的一個或多個部分的生物量的提高。依賴于農作物，植物的收獲部分可能為植物的不同部分或組織，例如種子(如水稻、高梁或為獲取種子而種植的玉米)；總的地上生物量(如，用作飼料的玉米、甘蔗)、根(如甜菜)、果實(如番茄)、棉纖維，或具有經濟價值的植物的任意其它部分。例如，本發明的方法用于提高水稻和玉米的種子產量，或在總的地上生物量和能量含量方面提高飼料玉米的產量。產量的增加包括種子產量的增加，包括種子的總生物量(總種子重量)的增加和/或飽滿種子(filled seed)數的增加和/或總種子數的增加。產量的增加也表現在收獲指數的增加，其中收獲指數表示為種子等可收獲部分的產量和總生物量的比例。
因此，提供了一種相對于相應的野生型植物而言提高植物產量，特別是種子產量的方法，包括主要在該植物的種子中導入和過表達編碼TAD蛋白，其同源物、衍生物或活性片段的核酸序列，其中產量的提高包括相對于相應的野生型植物增加的總種子重量、增加的飽滿種子數、或增加的收獲指數的至少其中之一。
產量本身為一種復雜的參數，其中總產量取決于一些產量成分。農作物增加的產量的參數為本領域的技術人員熟知。例如，農作物的關鍵產量參數包括每公頃或畝的植物數量，每株植物的抽穗數量，每穗的行數(種子)，每行的谷粒數，每千粒重量。根據本發明的方法獲得的產量的提高可以作為這些產量參數的一個或多個的結果而獲得。例如，水稻的關鍵產量參數為每公頃或每畝的植物數量、每株植物的散穗(panicle)數目、每散穗的小穗(spikelet)數目、種子飽滿率以及每千粒重量。根據本發明的方法獲得的產量的提高可以作為這些產量參數的一個或多個的結果而獲得。產量的提高優選通過主要基于提高每散穗花的數目以及提高種子飽滿率而獲得。
根據本發明的一個優選的性質，本發明的方法的完成導致植物具有改變的產量。改變的產量優選為種子產量增加，且包括散穗數目、每散穗的小穗數目、總種子數目、飽滿種子數、總種子重量、千粒重以及收獲指數中的至少一種的增加，每種均相對于對照植物而言。因此，根據本發明，提供了一種提高植物的種子總重、飽滿種子數和/或收獲指數的方法，該方法包括以種子優先的方式，調節植物中編碼TAD蛋白的核酸分子的表達和/或調節TAD本身的活性，優選其中TAD蛋白由SEQ ID NO1或其一部分或由能夠與其雜交的序列編碼，或其中TAD如SEQ ID NO2所示或為其同源物、衍生物或活性片段。
根據本發明的另一具體實施方式
，提供了用來幫助用于本發明的方法的核酸序列的導入和/或表達的遺傳構建體和載體，因此根據本發明的第二種具體實施方式
，提供了一種基因構建體，包括a.一種能夠調節編碼TAD蛋白的核酸的表達和/或TAD蛋白的水平和/或活性的核酸序列；b.能夠驅動(a)所述核酸序列表達的一種或多種調控序列；c.轉錄終止序列。
用于本發明的方法的構建體可以用本領域技術人員熟知的重組DNA技術建立。該基因構建體可以被插入載體，載體可以購買得到，適合于轉化入植物并適合感興趣基因在轉化細胞的表達。遺傳構建體可以為表達載體，其中核酸分子可操作性地與一種或多種調控序列連接，使其在原核和/或真核宿主細胞中表達。
根據本發明的一個優選的具體實施方式
，遺傳構建體可以為表達載體，設計用于過表達核酸分子；特別為主要在種子中獲得過表達，更特別在植物種子的胚乳中過表達。另外地和/或可選地，設計的表達載體用于在幼苗階段過表達核酸。能夠調節編碼TAD蛋白的核酸分子的表達的核酸分子優選為編碼TAD或其同源物、衍生物或活性片段的核酸分子，例如這里前述的任意的核酸分子。優選的核酸分子為SEQID NO1所示的序列或其一部分，或能夠與其雜交的序列，或編碼SEQID NO2所示的序列或編碼其同源物、衍生物或活性片段的核酸分子。該核酸優選相對于它操作性連接的調控序列以有義的方向克隆。
用含有感興趣序列(即編碼TAD蛋白的核酸分子)的載體轉化植物，該序列與一個或多個調控序列(至少一個啟動子)可操作地連接。術語“調控元件”、“調控序列”、“控制序列”和“啟動子”這里可互換使用和在廣泛的情形下使用，指能夠影響它們所連接的序列的表達的調節核酸，被前述術語包括的為來源于經典的真核基因組基因的轉錄調節序列(包括精確的轉錄起始所必需的TATA盒，具有或不具有CCAAT盒序列)以及附加的調控元件(即，上游活化序列，增強子，靜默子)，該序列根據發育和/或外部刺激而改變基因的表達，或以組織特異性的方式表達。經典的原核基因的轉錄調控序列也包含在該術語范圍內，在該情形下，它可以包括一個-35盒序列和/或-10盒轉錄調節序列。術語“調控序列”也包含賦予、活化或增強細胞、組織或器官中核酸分子表達的合成融合分子或衍生物，這里采用的術語“可操作性連接”指在啟動子序列和感興趣基因之間的功能性連接，從而使啟動子序列能夠起始感興趣基因的轉錄。
為了獲得需要的改變的生長特性，感興趣基因以合適的水平和以空間和發育的適宜模式表達很重要。編碼TAD蛋白的核酸分子優選與種子優先啟動子可操作地連接。這里定義的“種子優先”啟動子指在一個或多個種子組織中占絕對優勢表達的啟動子，該種子優先啟動子優選為胚乳優先啟動子，更優選GenBank中登錄號為X65064所示的啟動子(從核苷酸1到672的序列，這里以后命名為PRO0090)，或類似強度和/或類似表達模式的啟動子。因此，本發明也提供了一種改變植物的生長特性，特別是產量的方法，包括增加植物中編碼TAD蛋白的核酸的表達，其中增加的表達主要在種子中獲得。該表達優選在種子優先的啟動子的控制下實現，種子優先啟動子更加優選為胚乳優先啟動子，種子優先啟動子最優選PRO0090。然而，應當注意該PRO0090啟動子在幼苗中也有活性，因此本發明的方法也可以采用幼苗優先啟動子實行。因此，本發明也提供了一種改變植物的生長特性，特別是產量的方法，包括增加植物中編碼TAD蛋白的核酸的表達，其中增加的表達主要在幼苗中獲得。
啟動子的強度和/或表達模式可以通過例如將該啟動子與報告基因連接并檢測報告基因在不同的植物組織中的表達來分析。一個本領域技術人員熟知的合適的報告基因為β葡糖醛酸酶，接著啟動子的強度和/或表達模式可以與充分鑒定的參考啟動子比較，例如CaMV 35S啟動子或種子優先的水稻谷醇溶蛋白NRP33啟動子。非限制性的其它種子優先啟動子的例子列于表1中，這些啟動子或其衍生物也可以用于本發明的方法中。
表1.本發明的實行中示例性的種子優先啟動子
在導入植物的構建體中可以任意地采用一個或多個終止子序列。術語“終止子”包括為轉錄單位末端的DNA序列的控制序列，它給予初級轉錄本的3’端處理和聚腺苷酸化的信號和轉錄終止的信號。其它調控元件可以包括轉錄和翻譯增強子。本領域技術人員已知適合用于本發明的終止子和增強子序列，本領域技術人員可以知道并容易得到這種序列。
本發明的基因構建體可以進一步包括序列復制起點，它是在特定細胞類型中保持和/或復制所必需的。一個例子是當基因構建體在細菌細胞中作為游離體(episomal)遺傳元件(如，質粒或粘粒分子)需要保持的時候。優選的復制起點包括，但并不限于f1-ori和colE1。
該遺傳構建體可以任意地包括可選擇標記基因，這里采用的術語“可選擇標記基因”包括賦予它所表達的細胞表型的任意基因，以協助識別和/或選擇用本發明的核酸構建體轉染或轉化的細胞。合適的標記可以選自導致抗生素或除草劑抗性的標記，引入新的新陳代謝特性或允許視覺選擇的標記。可選擇標記蛋白的例子包括，導致對抗生素(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII，或能夠磷酸化潮霉素的hpt)，對除草劑(例如bar，提供Basta抗性；aroA或gox，提供草甘膦抗性)產生抗性的蛋白，或提供新陳代謝特性的基因(如manA，允許植物利用甘露糖作為唯一的碳來源)。可見的標記基因導致顏色的形成(例如β葡糖醛酸酶，GUS)，發光(例如熒光素酶)或熒光(綠色熒光蛋白，GFP，和其衍生物)。
在一個優選的具體實施方式
中，上述的遺傳構建體包括以有義方向與啟動子偶聯的TAD，該啟動子優選為種子優先和/或幼苗優先啟動子，例如PRO0090啟動子。因此，本發明的另一方面為一種含有本質上與SEQ ID NO 3相同的表達盒的載體構建體，含有PRO0090啟動子，煙草TAD基因以及T-玉米醇溶蛋白+T-rubisco轉錄終止子序列。一個與SEQ ID NO 3本質上相同的序列包括編碼SEQ ID NO 2的同源性蛋白或與SEQ ID NO 1雜交的第一核酸序列，該第一核酸與PRO0090啟動子或一個有相似表達模式和水平的啟動子操作性地連接，該第一核酸任意地與轉錄終止序列連接。
本發明還包括通過本發明的方法得到的植物，本發明因此提供通過本發明的方法所得到的植物，該植物具有增加的產量，特別是具有增加的總種子重量、增加的總種子數目、增加的飽滿種子數和/或增加的收獲指數，且該植物具有改變的編碼TAD蛋白的核酸序列的表達和/或改變的TAD蛋白活性。與相應的野生型植物對比，改變的表達和/或活性優選主要在種子和/或幼苗中實現。與相應的野生型植物對比，改變的表達和/或活性優選為增加的表達和/或活性。
更加具體的，本發明提供了一種生產具有改變的生長特性的轉基因植物的方法，該方法包括(i)向植物或植物細胞中導入編碼TAD蛋白或其同源物、衍生物或活性片段的核酸分子或其一部分；(ii)在促進再生和成熟植物生長的條件下培養植物細胞。
蛋白本身和/或核酸本身可以被直接導入植物細胞或植物本身(包括導入植物的組織、器官或任意其它部位)。根據本發明的一個優選性質，核酸優選通過轉化導入植物。核酸優選為SEQ ID NO1所示的核酸或其一部分或能夠與其雜交的序列，或編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列或其同源物、衍生物或活性片段的核酸。核酸序列優選在種子/幼苗優先的啟動子的控制下，更優選PRO0090啟動子。
這里涉及的術語“轉化”包括將外源性多核苷酸轉移到宿主細胞中，而不考慮用來轉移的方法。能夠隨后進行無性繁殖的植物組織，無論通過器官形成或胚形成，都可以用本發明的基因構建體來轉化，整株植物從那里再生。選擇的特定組織將根據可利用的無性繁殖系統而變化，且最好適合于被轉化的特定物種。代表性的目標組織包括葉片、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子體、胼胝體組織、現存的分生組織(例如，頂端分裂組織，葉腋芽，以及根部分裂組織)，和誘導的分裂組織(例如，子葉分裂組織和下胚軸分裂組織)。多核苷酸可以被瞬時或穩定導入宿主細胞并可以非整合保持，例如，作為質粒。可選地，它可以整合入宿主基因組，獲得的轉化植物細胞可以用于以本領域技術人員已知的方式使轉化植物再生。
目前植物物種的轉化是一種相當常規的技術，可以方便的采用幾種轉化方法的任意一種來將感興趣核酸導入一種合適的祖先細胞。轉化方法包括運用脂質體、電穿孔、增加自由DNA攝入的化學物質、向植物中直接注射DNA、粒子槍轟擊、用病毒或花粉轉化或顯微發射。方法可以選自用于原生質體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生質體的電穿孔(Shillito R.D.等，1985Bio/Technol 3，1099-1102)；向植物材料微注射(Crossway A.等，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；DNA或RNA-包被粒子轟擊(Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)用病毒及類似物感染(非整合的)。一種本發明優選的水稻轉化方法為Hiei等(Plant J.6，271-282，1994)的方案。優選的高效轉化玉米的方法為Ishida等(1996，Nat Biotechnol.14，745-50)以及Frame等(2002，PlantPhysiol.129，13-22)描述的方案，該公開在這里作為參考引用，如同全部列出一樣。
通常轉化后，篩選植物細胞或細胞組一個或多個標記的存在，該標記被與感興趣基因共轉移的植物可表達的基因編碼，接著轉化材料再生為完整的植株。
DNA轉移和再生后，可以測定推定被轉化植物的感興趣基因的存在、拷貝數和/或基因組組成，例如運用Southern分析，可選地或附加地，新導入的DNA表達水平可以用Northern和/或Western分析，兩種技術都為本領域普通技術人員所熟知。
在選擇的下一步驟，評估轉化植物的需要的表型。本領域技術人員，如植物分子生物學家已知，植物中轉基因的表達，以及因此由于該轉基因表達導致的表型效應在不同的獨立獲得的轉基因品系中和其后代中可能不同。在不同的獨立獲得的轉基因植物中存在的轉基因基于染色體插入位點和插入該位點的轉基因拷貝的數目以及該位點的這些轉基因的結構而彼此不同。表達水平的不同可以描述為受轉基因的染色體環境的影響(所謂的位置效應)或由一定的轉基因構象引發的靜默機制(例如，內向面對串聯插入的轉基因傾向于在轉錄或轉錄后水平靜默)產生的轉化植物可以通過多種方式繁殖，如通過無性繁殖或傳統培育技術。例如，第一代(或T1)轉化植物可以自花受精產生純合子的第二代(或T2)轉化子，T2植物進一步通過經典培育技術繁殖。
產生的轉化有機體可以采取多種形式，例如它們可以是轉化細胞和非轉化細胞的嵌合體；無性繁殖轉化體(例如，所有的轉化細胞含有表達盒)；轉化和非轉化組織的嫁接體(例如，在植物中，將轉化的根莖嫁接到未轉化的幼芽上)。
本發明無疑延伸至這里描述的任意方法所產生的任意植物細胞或植物及其所有的植物部分、種子和繁殖體。本發明進一步延伸，包含了由任意的前述方法產生的初級轉化和轉染的細胞、組織、器官或整株植物的后代，唯一的要求為后代表現出與通過本發明的方法在親本中產生同樣的基因型和表型特征。本發明也包括含有編碼TAD蛋白的分離核酸分子的宿主細胞。根據本發明優選的宿主細胞是植物細胞。本發明也擴展到本發明植物的可收獲部分，例如但并不限于種子、葉、果實、花、莖或莖培養物、根莖、根、塊莖和鱗莖。
這里采用的術語“植物”包括整株植物、植物的原種和后代和植物部分，包括種子、果實、花、芽、葉、莖、根(包括塊莖)、以及植物細胞、組織和器官。術語“植物”也包括懸浮培養物、胚、分生組織區域、駢胝組織、配子體、孢子體、花粉、以及小孢子。本發明的方法中特別有用的植物包括藻類、蕨類植物以及所有屬于Viridiplantae的植物，特別是單子葉植物和雙子葉植物，包括飼料或草料豆類、裝飾植物、食品農作物、樹木、或灌木，從包括下列的植物中選擇煙草屬(Abelmoschus spp.)，槭樹屬(Acer spp.)、獼猴桃屬(Actinidia spp.)，Agropyron spp.，蔥屬(Allium spp.)，莧屬(Amaranthus spp.)，菠蘿(Ananas comosus)，番荔枝屬(Annonaapp).，旱芹(Apium graveolens)，擬南芥(Arabidopsis thaliana)，落花生屬(Arachis spp.)，波蘿屬(Artocarpus spp.)，石刁柏(Asparagus officinalis)，燕麥(Avena sativa)，陽桃(Averrhoacarambola)，冬瓜(Benincasa hispida)，Bertholletia excelsea，紅柄添菜(Beta vulgaris)，蕓苔屬(Brassica spp.)，Cadabafarinosa，大葉茶(Camellia sinensis)，美人蕉(Canna indica)，辣椒屬(Capsicum spp.)，番木瓜(Carica papaya)，大花假虎刺(Carissa macrocarpa)，紅花(Carthamus tinctorius)，核桃木(Carya spp.)，板栗屬(Castanea spp.)，萵苣葉(Cichoriumendivia)，香樟屬(Cinnamomum spp)，西瓜(Citrullus lanatus)，柑橘屬(Citrus spp.)，椰子屬(Cocos spp.)，咖啡屬(Coffea spp.)，Cola spp.，芋(Colocasia esculenta)，榛屬(Corylus spp.)，山楂屬(Crataegsu spp.)，香瓜屬(Cucumis spp.)，南瓜屬(Cucurbitaspp.)，薊屬(Cynara spp.)，胡蘿卜(Daucus carota)，角絲鼓藻屬(Desmodium spp.)，龍眼(Dimocarpus longan)，山藥屬(Dioscorea spp.)，柿樹屬(Diospyros spp.)，稗屬(Echinochloaspp.)，移子(Eleusine coracana)，枇杷(Eriobotrya japonica)，紅果仔(Eugenia uniflora)，蕎麥屬(Fagopyrum spp.)，水青屬(Fagus spp.)，無花果(Ficus carica)，金柑屬(Fortunella spp.)，草莓屬(Fragaria spp.)，銀杏(Ginkgo biloba)，大豆屬(Glycinespp.)，陸地棉(Gossypium hirsutum)，向日葵(Helianthus spp.)，木樓屬(Hibiscus spp.)，大麥屬(Hordeum spp.)，甘薯(Ipomoeabatatas)，核桃屬(Juglans spp.)，萵苣(Lactuca sativa)，香碗豆屬(Lathyrus spp.)，浮萍屬(Lemna spp.)，兵豆(Lensculinaris)，亞麻(Linum usitatissimum)，荔枝(Litchichinensis)，百脈根屬(Lotus spp.)，棱角絲瓜(Luffaacutangula)，羽扇豆屬(Lupinus spp.)，Macrotyloma spp.，Malpighia emarginata，蘋果屬(Malus spp.)，滿梅果(Mammeaamericana)，杧果(Mangifera indica)，木薯屬(Manihot spp.)，人心果(Manilkara zapota)，紫苜蓿(Medicago sativa)，草木樨屬(Melilotus spp.)，薄荷屬(Mentha spp.)，Momordica spp.，黑桑(Morus nigra)，香蕉屬(Musa spp.)，煙草屬(Nicotiana spp.)，Olea spp.，仙人掌屬(Opumtia spp.)，Ornithopus spp.，野生稻屬(Oryza spp.)，黍(Panicum miliaceum)，西番蓮(Passifloraedulis)，美洲防風(Pastinaca sativa)，酪梨屬(Persea spp.)，歐芹(Petroselinum crispum)，菜豆屬(Phaseolus spp.)，海棗(Phoenix spp.)，酸漿屬(Physalis spp.)，松屬(Pinus spp.)，開心果(Pistacia vera)，豌豆屬(Pisum spp.)，早熟禾屬(Poaspp.)，楊樹(Populus spp.)，牧豆樹(Prosopis spp.)，櫻桃(Prunus spp.)，石榴屬(Psidium spp.)，安石榴(Punica granatum)，西洋梨(Pyrus communis)，橡樹屬(Quercus spp.)，蘿卜(Raphanussativus)，大黃(Rheum rhabarbarum)，茶藨屬(Ribes spp.)，鉤子屬(Rubus spp.)，甘蔗(Saccharum spp.)，Sambucus spp.，黑麥(Secale cereale)，Sesamum spp.，馬鈴薯屬(Solanum spp.)，高梁(Sorghum bicolor)，Spinacia spp.，蒲桃屬(Syzygium spp.)，酸豆(Tamarindus indica)，可可(Theobroma cacao)，Trifoliumspp.，Triticosecale rimpaui，小麥屬(Triticum spp.)，越桔屬(Vaccinium spp.)，野豌豆屬(Vicia spp.)，豇豆(Vigna spp.)，葡萄(Vitis spp.)，玉蜀黍(Zea mays)，野生稻(Zizania palustris)，棗(Ziziphus pp.)，等等。
本發明的方法對應用于農作物植物中特別有利，因為本發明的方法用于提高植物的產量，特別是種子產量，更特別為種子的總重量、飽滿種子的數量和收獲指數。因此，本發明的方法在收獲種子的谷類植物中特別有用，例如谷類、向日葵、大豆、棉花、豌豆、亞麻、羽扇豆、油菜(canola)等等，但也可用于收獲生物量的農作物中。根據本發明的優選特性，植物為農作物植物，包括大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽(rapeseed)或棉花。本發明的植物更加優選為單子葉植物，包括禾本科的成員，例如甘蔗，最優選谷類，例如水稻、玉米、小麥、粟、大麥和高梁。相應地，本發明的一個特別的具體實施方式
涉及提高谷類的產量，特別是種子的總重量、飽滿種子的數量、總種子數和/或收獲指數的方法。
本發明也涉及分離的編碼TAD蛋白的核酸及其片段或與之雜交的核酸在改變植物的生長特性中的應用，優選提高植物產量，更加優選植物的種子產量，特別是種子的總重量、飽滿種子的數量、總種子數和/或收獲指數，其中編碼TAD蛋白的核酸，其片段或與之雜交的核酸以種子優先的方式表達。本發明也涉及TAD蛋白的應用及其同源物、衍生物和活性片段在改變植物生長特性中的應用，特別是提高植物的種子的總重量、飽滿種子的數量、總種子數和/或收獲指數中的應用，核酸序列優選SEQ ID NO1所示的或其一部分，或能夠與之雜交的序列，或編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列或其同源物、衍生物或活性片段。本發明還包括植物或植物部分(包括種子)在加工中的應用，該植物或植物部分具有改變的編碼TAD蛋白的核酸的表達和/或改變的TAD蛋白的活性。這種對加工的應用包括在食品或飼料生產、釀造、在生產工業蛋白質或醫藥品、在生產糖或油中的應用。
如上所述，本發明的方法產生具有改變的生長特性的植物。這些有利的生長特性也可以與其它的經濟學優勢特性結合，例如進一步的產量增加特性、對各種應激的耐受性、改變各種結構特征的特性和/或生物化學和/或生理學性質。相應地，本發明的方法也可以用于所謂的“基因堆疊”(gene stacking)步驟。
本發明將參考下列附圖進行描述，其中


圖1進入克隆p69的示意圖，在AttL1和AttL2位點內含有CDS0671，在pDONR201的框架內進行Gateway克隆。CDS0671為煙草BY2細胞TOB3樣AAA-ATPase結構域編碼序列的內在編號。該載體還含有一個細菌卡那霉素抗性盒和細菌復制起點。
圖2在胚乳/幼苗優先的啟動子PRO0090的調控下，在水稻中表達煙草BY2細胞TOB3樣AAA-ATPase結構域基因(CDS0671)的二元載體。該載體含有來源于Ti質粒的T-DNA，被左邊界(LB重復，LB TiC58)和右邊界(RB重復，RB Ti C58))限定。從左邊界到右邊界，該T-DNA含有植物可選擇標記以及可篩查的標記物，以選擇和篩查轉化植物；表達煙草BY2細胞TOB3樣AAA-ATPase結構域基因的PRO0090-CDS0671一玉米醇溶蛋白和rbcS-deltaGA雙終止子盒。該載體也含有來自pBR322的復制起點以進行細菌復制，以及一個可選擇標記物(Spe/SmeR)，以用壯觀霉素和鏈霉素進行細菌選擇。
圖3序列表。
實施例本發明將通過參考下列實施例加以描述，所述實施例僅用于說明的目的。
DNA操作除非另外說明，重組DNA技術根據(Sambrook(2001)分子克隆實驗室手冊，第三版，冷泉港實驗室出版社，CSH，紐約)或第1和2卷的Ausubel等人(1984)，Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols中所描述的標準操作程序進行。植物分子工作的標準的材料和方法在Plant Molecular BiologyLabfase(1993)中描述，作者R.D.D.Croy，BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
實施例1CDS0671的克隆從煙草中克隆TAD基因片段對同步化的煙草BY2細胞培養物(Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow-2)進行cDNA-AFLP試驗，選擇細胞周期調節的BY2表達序列標簽進行進一步的克隆。表達序列標簽用于篩選煙草cDNA文庫和分離感興趣cDNA，即編碼TOB3樣AAA-ATPase結構域基因的一個克隆(CDS0671)。
BY2細胞的同步化按下述方法通過用蚜棲菌素將細胞阻滯在早S期而使煙草BY2(Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow-2)培養細胞懸液同步化。Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow 2的細胞懸液按照所述的方法維持培養(Nagata等Int.Rev.Cytol.132，1-30，1992)。為進行同步化，用加入了一種DNA聚合酶α抑制藥物即蚜棲菌素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；5mg/l)的新鮮培養基將培養7天的靜止培養物稀釋10倍。24小時后，通過用新鮮培養基洗滌數次將細胞從阻滯中釋放，然后其細胞周期進程繼續進行。
RNA提取和cDNA合成。
采用LiCl沉淀制備總RNA(Sambrook等，2001)，用Oligotex柱子(Qiagen，Hilden，Germany)根據廠商的說明書從500μg總RNA中提取poly(A+)RNA。從1μg的poly(A+)RNA開始，用生物素化的oligo-dT25引物(Genset，Paris，France)以及SuperscriptII(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)反轉錄合成第一鏈cDNA，用大腸桿菌連接酶(Life Technologies)、DNA聚合酶I(USB，Cleveland，OH)和RNAse-H(USB)進行鏈替代合成第二鏈。
cDNA-AFLP分析。
用500ng雙鏈cDNA按照經調整的所述的方法進行AFLP分析(Vos等，Nucleic Acids Res.23(21)4407-4414，1995；Bachem等，PlantJ.9(5)745-53，1996)。采用的限制性內切酶為BstYI和MseI(Biolabs)，在兩個分別的步驟中進行消化。在用其中一種酶進行第一次限制性消化后，通過它們生物素化的尾巴而將3′末端片段捕獲于Dyna珠(Dynal，Oslo，Norway)，而其它片段被沖洗掉。在用第二種酶消化后，收集釋放的限制性片段，并用作后繼的AFLP步驟的模板。為進行預擴增，將沒有選擇性的核苷酸的MseI引物與含有T或C作為最3′端核苷酸的BstYI引物組合。PCR條件按照所述進行(Vos等，1995)。將獲得的擴增混合物稀釋600倍，采用P33標記的BstYI引物和Amplitaq-Gold聚合酶(Roche Diagnostics，Brussels，Belgium)將5μl用于選擇性擴增。擴增產物采用Sequigel系統(Biorad)在5％聚丙烯酰胺凝膠上分離。將干膠暴露于Kodak Biomax膠片以及在Phosphor Imager(Amersham Pharmacia Biotech，Little Chalfont，UK)中掃描。
AFLP片段的鑒定。
從膠中分離并洗提相應于不同表達轉錄本的條帶，其中有相應于SEQ ID NO 1(或CDS0671)的(部分)轉錄本。在與選擇性擴增同樣的條件下進行DNA擴增。通過用選擇性BstYI引物對擴增聚合酶鏈反應產物的直接測序或在將片段克隆入pGEM-T easy(Promega，Madison，WI)后對單獨的克隆進行測序而獲得序列信息。將獲得的序列通過BLAST序列比對與公共數據庫中的核苷酸和蛋白進行對比(Altschul等，Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402 1997)。在可獲得時，將標簽序列用較長的EST或分離的cDNA序列替換，以增加發現顯著的同源物的機會。相應于SEQ ID NO 1(CDS0671)的物理cDNA克隆隨后從商業煙草cDNA文庫中按下列方法擴增。
TAD基因片段(CDS0671)的克隆。
從分離自活性分裂、非同步化的BY2煙草細胞的poly(A+)RNA制備平均插入大小為1,400bp的cDNA文庫。這些文庫-插入序列被克隆入載體pCMVSPORT6.0中，后者含有attB Gateway盒(LifeTechnologies)。從該文庫中選擇46,000個克隆，排列于384孔的微滴定板，隨后在尼龍濾紙上副本點樣。用幾百個放射性標記的標簽(包括相應于序列CDS0671、SEQ ID NO 1的BY2標簽)作為探針篩查排列的克隆。分離陽性克隆(其中具有相應于CDS0671，SEQ I NO 1的克隆)，進行測序，并與標簽序列比對。在與標簽雜交失敗的情況下，通過PCR擴增選擇相應于標簽的全長cDNA采用primer 3程序設計標簽特異性的引物(http//www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html)并用于與普通的載體引物組合擴增部分cDNA插入片段。將來自50,000、100,000、150,000和300,000cDNA克隆的DNA庫用作PCR擴增的模板。接著將擴增產物從瓊脂糖凝膠中分離、克隆、測序并將它們的序列與標簽序列比對。
然后，通過LR反應將相應于SEQ ID NO 1核酸序列的全長cDNA從pCMVsport 6.0文庫載體中克隆入pDONR201，即一個Gateway供體載體(Invitrogen，Paisley，UK)，獲得進入克隆p69(
圖1)。
實施例2用PRO0090-CDS0671盒進行轉化的載體構建隨后進入克隆p69被用于與一個用于水稻轉化的目的載體(destination vector)p0830的LR反應。該載體在T-DNA界限的范圍內含有作為功能元件的植物可選擇標記；篩查標記以及用于與已經克隆入進入克隆的感興趣序列在體內進行LR重組的Gateway盒。啟動子PRO0090位于該Gateway盒的上游。
LR重組步驟后，得到的表達載體p74(圖2)被轉化入農桿菌屬(Sgrobacterium)菌株LBA4404，并隨后導入水稻植株中。
實施例3用PRO0129up-CDS0716轉化水稻將Oryza sativa japonica cultivar Nipponbare的成熟的干燥種子脫殼。通過將種子在70％的乙醇中孵育1分鐘，然后在0.2％HgCl2中30分鐘進行消毒，并用消毒蒸餾水15分鐘洗滌6次。接著使消毒的種子在含有2，4-D的培養基(愈傷組織誘導培養基)中發芽。在黑暗中孵育4周后，將胚發生的來自盾片的愈傷組織切下并在相同的培養基中繁殖。2周后，通過在同樣的培養基中再培養2周而繁殖愈傷組織。在共同培養3天前，將胚發生的愈傷組織片在新鮮的培養基中再培養以增進細胞分裂活性。攜帶二元載體p3076的農桿菌屬(Agrobacterium)株系LBA4404用于共培養。用合適的抗生素在28℃將農桿菌屬(Agrobacterium)株系在AB培養基中培養3天。接著收集細菌并以OD600大約為1在液體共培養基中懸浮。將懸浮液轉移到培養皿，將愈傷組織在懸浮液中沉浸15分鐘。接著將愈傷組織在濾紙上點干，轉移到凝固的共培養基中，并在黑暗中25℃孵育3天。
然后將共培養的愈傷組織在含有2，4-D的培養基中在合適濃度的選擇試劑的存在下，在28℃的黑暗中生長4周。在這期間，迅速生長的抗性愈傷組織發育。在將該材料轉移到再生培養基和在光照下孵育后，釋放了胚生成潛力，芽苗在下面的4到5周內發育。從愈傷組織剪除芽苗，并在含有植物激素的培養基中孵育2到3周，然后轉移到土壤中。將變硬的芽苗在溫室中高濕度和短日照下生長。最后在移植后3到5個月收獲種子。該方法以大于50％的比例生產單位點的轉化株(Aldemita和Hodges，1996，Chan等，1993，Hiei等，1994)。
實施例4.用PRO0129-CDS1585轉化的轉基因水稻的評估大約產生15到20株獨立的T0水稻轉化株。將初級T0轉化株從組織培養室轉移到溫室，以培育和收獲T1種子。其中保留T1后代按轉基因的存在/缺乏分離為3∶1的7種事件。對每種事件，通過監測可篩查標記的表達而選擇含有轉基因(異源和同源受精卵)的大約10個T1幼苗，以及缺乏轉基因的大約10個T1幼苗(空接合子)。
將選擇的T1植物轉移到溫室中，每株植物都接受到獨特的條形碼(barcode)標記以將表型數據和相應植物清楚地相互連鎖。選擇的T1植物在10cm直徑的罐中的土壤中栽培，在下列環境設置下光周期＝11.5h，光照強度＝30,000勒克斯或更大，日間溫度＝28℃或更高，夜間溫度＝22℃，相對濕度＝60-70％。轉基因植物和相應的空受精卵在隨機位置并行培育。從播種期直到成熟期，植物多次通過數字成像室。每次從至少6個不同角度拍攝每株植物的數字圖像(2048×1536像素，16百萬顏色)。
收獲、裝袋、并用條形碼標記成熟的初級圓錐花序，然后在烤箱中37℃干燥3天。圓錐花序接著被脫粒，并收集所有種子。用吹風裝置將飽滿的殼與空殼分離。分離后，將兩種種子用可商業化購買得到計數器計數。將空殼丟棄，飽滿的殼在分析天平上稱重，對種子的橫截面積用數字成像進行測量。該操作步驟導致下面描述的種子相關參數(i)飽滿種子數通過對分離步驟后保留的飽滿殼的計數來確定飽滿種子的數目。
(ii)每株植物的總種子重量通過稱量從植物收獲的所有飽滿殼的重量來測量總種子重量。
(iii)植物的收獲指數本發明的收獲指數定義為總種子重量和地上面積(mm2)的比例，再乘以106。
采用圖像分析軟件這些參數從數字圖像以自動方式獲得并進行統計學分析。用經不均衡設計矯正的雙因子ANOVA(離差分析)作為植物表型性狀的總體評估統計模型。對所有用感興趣基因轉化的所有植物，對所有檢測的參數進行F檢驗。進行F檢驗來檢測所有的轉化事件中的基因的效果并檢驗基因總的效果，這里也稱為“綜合基因效果”。通過F檢驗值確定的有意義的數據，表明了“基因”效果，表示觀察到的效果不僅由基因的存在或位置引起。在F檢驗的情況下，真正綜合基因效果的顯著性的閾值設置為5％概率水平。
為檢測每一事件內基因的效應，即，線性特異性效應，采用從轉基因植物以及相應的空載植物中獲得的數據在每一個事件內進行t檢驗。“空載植物”或“空載分離株”或“空受精卵”為用與轉基因植物同樣的方式處理的植物，但其中轉基因被隔離。空載植物也可以被描述為純合子陰性轉化植物。T檢驗的顯著性的閾值設為10％概率水平。一些事件的結果可能在該閾值之下或之上，這基于基因可能只在基因組的特定位置時才有效應的假設，該位置依賴性效應的發生率并非罕見。這種基因效應也可以稱為“基因的線性效應”，p值通過比較t-分布與t值，或者比較F分布與F值而得到。然后P值給出了零假設(即轉基因沒有任何效應)正確的概率。
按照上述的方法測量植物生長和種子產量。發現在用TAD編碼序列轉化的植物中，總種子重量、飽滿種子數和收獲指數與沒有TAD編碼序列的對照植物相比有所增加。
在第一個試驗中獲得的數據在T2植物的第二個試驗中得到證實。通過監測標記的表達篩查來自T1陽性植物的一批種子(純合子和雜合子)。對每一選擇的事件，保留雜合子種子批次進行T2評估。在每一種子批次內，在溫室中培育相等數目的陽性和陰性植物進行評估。選擇3株系的具有正確的表達模式的植物進行進一步分析。
T2代中總共評估了120株TAD轉化植物，每一事件40株植物，其中20株為轉基因陽性，20株為陰性。
實施例5.用PRO0090-CDS0671轉化的轉基因植物的評估結果在T1代中，5個檢測種系中的4種表現出飽滿種子數、總種子重量、以及收獲指數的增加。對于最好的品系(品系21)，3種不同種子產量參數的增加達到大約50％，p值均較低(表2)。
表2品系21的種子產量的增加
從進行確證采用的4株陽性T1種系以及3株T2種系中計算的平均增值與空受精卵(nullizygous)植物對比的不同的種子產量參數列于表3。
表3T1和T2代的種子產量的平均增長
T1植物的結果用T2植物確定。這里各種參數也均有增加(表3)。當T1和T2植物的數據結合并重新分析，發現了對飽滿種子數、總種子重量和收獲指數的積極效果十分顯著(見表3中的p值，右欄)。
實施例6本發明在玉米中的應用這里所述的本發明的方法也在玉米中采用。為達到這一目的，TAD基因，或其玉米直向同系物(orthologue)，在合適的啟動子(優選種子和/或幼苗優先啟動子)的控制下，在適合于農桿菌屬(Agrobacterium)介導的玉米轉化的植物轉化載體中克隆。用于玉米轉化的這種載體和方法在文獻中已經記載(EP0604662、EP0672752、EP0971578、EP0955371、EP0558676、Ishida等人，1996；Frame等人，2002)。通過這些方法制備的轉基因植物在溫室中生長，進行T1種子生產。通過后代分離分析檢測遺傳可能性，通過定量實時PCR和/或Southern印跡分析來檢測轉基因的拷貝數，通過反轉錄PCR和/或Northern分析確定轉基因的表達水平。選擇具有轉基因的單拷貝插入和具有轉基因表達水平改變的轉基因系通過自花受精或與其它種質交叉受精進行T2種子生產。使后代種子發育，在田野或溫室中以非常適合玉米的條件下生長(16:8hr光周期，26-28℃日間溫度和22-24℃夜間溫度)，還在缺乏水、缺乏氮以及過量NaCl的條件下進行。在自花受精的情況下，用從同一母系的零分離種以及同一栽培變種的野生型植物作為對照。在交叉受精的情況下，同一栽培變種的轉基因、零分離種和野生型植物與所選的親本交叉受精，且將來自轉基因交叉受精的F1植物與來自零分離種和野生型交叉受精的F1植物相對比。對自花受精或交叉受精的后代植物的不同的生物量和發育參數進行評估，包括植物高度，莖/干的厚度，葉子數目，總地上面積，葉子的綠色度，成熟時間，開花時間，抽穗數目，收獲時間。也對這些種系的種子的多種參數進行測定，例如谷粒大小，每株植物的總谷粒產量，谷粒質量(淀粉含量，蛋白含量和油含量)。選擇與相應的對比系相比上述的任一參數有最顯著地提高的植物系進行進一步的田間測驗和標記輔助的育種，目標是將田間有效的轉基因品質轉移到商品化的種質。在田間對玉米生長和產量相關參數的檢測方法在現有技術中已經良好地確立，如將特定基因座位(例如含有轉基因的位點)從一種種質轉移到另一種質的技術。
權利要求
1)一種相對于相應野生型植物提高植物產量的方法，包括改變植物中分離的編碼TAD蛋白或其同源物、衍生物或活性片段的核酸序列的表達和/或改變植物中TAD蛋白或其同源物、衍生物或活性片段的活性。
2)根據權利要求1的方法，其中所述的改變通過重組手段和/或化學手段實現。
3)根據權利要求1或2的方法，其中所述的改變表達包括向植物中導入編碼TAD蛋白或其同源物、衍生物或活性片段的核酸序列。
4)根據權利要求1到3的任意一項的方法，其中所述的提高產量包括提高種子產量。
5)根據權利要求4的方法，其中所述的提高種子產量至少包括飽滿種子數的提高。
6)根據權利要求4的方法，其中所述的提高種子產量至少包括總種子重量的提高。
7)根據權利要求4的方法，其中所述的提高種子產量至少包括收獲指數的提高。
8)根據權利要求1到7任意一項的方法，其中所述的編碼TAD蛋白的核酸序列來源于植物。
9)根據權利要求1到8任意一項的方法，其中所述的改變表達為與相應的野生型植物相比過表達。
10)包括下述各項的構建體a.一種能夠改變編碼TAD蛋白的核酸的表達和/或TAD蛋白的活性的核酸序列；b.一種或多種能夠驅動(a)項的核酸序列表達的調控序列；c.一種轉錄終止序列。
11)根據權利要求10的構建體，其中所述的核酸編碼TAD蛋白。
12)生產與相應的野生型植物相比具有增加的產量的轉基因植物的方法，該方法包括a.向植物或植物細胞中導入編碼TAD蛋白或其同源物、衍生物或活性片段的核酸序列或其片段；b.在促進再生和成熟植物生長的條件下培養該植物細胞。
13)與相應的野生型植物相比具有增加的產量的轉基因植物，其特征在于所述的轉基因植物具有改變的編碼TAD蛋白的核酸序列的表達和/或改變的TAD蛋白的活性。
14)權利要求13的轉基因植物，其中所述改變的表達和/或改變的活性為與相應的野生型植物相比增加的表達和/或增加的活性。
15)根據權利要求13或14的轉基因植物，其中所述的植物為農作物，例如大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽或棉花，優選為單子葉植物，例如甘蔗，最優選為谷物，例如水稻、玉米、小麥、粟、大麥、高梁。
16)根據權利要求13到15的任一項的植物的轉基因植物細胞、轉基因植物部分，包括可收獲部分，繁殖體、種子或后代。
17)編碼TAD蛋白的核酸序列和/或TAD蛋白在增加產量中的應用。
18)權利要求17的應用，其中所述增加的產量包括增加的種子產量。
19)權利要求18的應用，其中所述增加的種子產量包括增加的飽滿種子數、增加的總種子重量或增加的收獲指數的至少一種。
20)根據權利要求13到15的任一項的轉基因植物、其植物部分或種子在加工中的應用。
全文摘要
本申請涉及一種通過改變植物中編碼TAD蛋白的核酸序列的表達和/或通過改變植物中TAD蛋白的活性來改變植物的生長特性的方法。本發明還涉及具有改變的生長特性的轉基因植物，該植物具有編碼TAD蛋白片段的核酸表達的改變。
文檔編號A01H5/00GK1768144SQ200480008855
公開日2006年5月3日 申請日期2004年2月16日 優先權日2003年4月1日
發明者Y·哈茨費爾德, V·弗蘭克卡德 申請人:作物培植股份有限公司