專利名稱：具有改良生長特性的植物及其制備方法
技術領域：
本發明一般地涉及分子生物學領域，并涉及改良植物生長特性的方法。更具體地，本發明涉及通過增加植物中YIPPEE樣多肽或其同源物的活性來改良植物生長特性尤其是產率的方法。本發明還涉及具有增加活性的YIPPEE樣多肽或其同源物的植物，這些植物相對于相應的野生型植物，具有改良的生長特性。本發明還提供在發明方法中有用的構建體。
背景技術：
世界人口的不斷增長和用于農業的可耕種土地供給的減少，推動農業研究向著提高農業效率的方向發展。農作物和園藝改良的常規方法是利用選育技術來鑒定具有所希望特性的植物。然而，這種選育技術有幾個缺點，即這些技術通常是勞動密集型的，并且產生通常含有異源遺傳組分的植物，這些遺傳組分并非總是產生從親本植物傳遞的所希望的性狀。分子生物學的進展已經允許人類改造動物和植物的種質(germplasm)。植物基因工程需要分離和操作遺傳物質(通常以DNA或RNA的形式)及隨后將此遺傳物質導入植物。這種技術使能夠遞送具有多種改良的經濟、農業或園藝性狀的農作物或植物。具有特別經濟利益的一個性狀是產率。產率通常被定義為來自農作物經濟價值的可測量產出。其可以根據數量和/或質量來定義。產率直接依賴于幾種因素，例如器官的數量和大小，植物構造(例如分枝數)，種子產量及更多的因素。根的發育，營養吸收和脅迫耐受性也是決定產率的重要因素。可以通過優化上述因素之一來增加農作物的產率。
改良植物多種生長特性的能力將在諸如增強農作物、植物育種、觀賞植物的生產、樹木栽培(aboriculture)、園藝學和林業等領域具有許多應用。改良的生長特性，如產率，也可以用于在生物反應器中使用的藻類生產(用于諸如藥物、抗體或疫苗物質的生物技術生產，或用于有機廢物的生物轉化)及其它這類領域。
現已發現，與相應野生型植物相比，增強植物中YIPPEE樣多肽的活性使植物具有改良的生長特性。
YIPPEE基因在果蠅中首次發現，并揭示了在真核生物中高度保守的推定鋅結合蛋白質的新家族(Roxstrom-Lindquist K.和Faye I.(2001)Insect Mol Biol.10(1)77-86)。對YIPPEE蛋白質進行了表征，并發現其含有一個推定的鋅指樣金屬結合結構域。它是該保守基因家族蛋白質中第一個被表征的成員，所述保守基因家族蛋白質存在于從細胞狀黏菌到人類的多種真核生物中。YIPPEE基因普遍表達于果蠅的不同發育階段。YIPPEE樣序列在廣泛物種范圍中的高度保守性表明YIPPEE蛋白質在真核生物中的普遍重要性。
發明內容
根據本發明，提供了改良植物生長特性的方法，其包括增加植物中YIPPEE樣多肽或其同源物的活性。
有利地，執行本發明的方法使植物具有多種改良的生長特性，尤其是增加的產率，特別是種子產率。
本文所定義術語“增加的產率”意指相對于相應的野生型植物，在以下任一或多個方面的增加(i)植物的一個或多個部分，特別是地上(可收獲)部分增加的生物量(重量)、增加的根生物量或者任何其它可收獲部分增加的生物量；(ii)增加的種子產率，包括種子生物量(種子重量)的增加，并且可以是每株植物種子重量或以單個種子為基礎的增加；(iii)增加的飽滿種子數量；(iv)增加的種子大小，其也可能影響種子的組成；(v)增加的種子體積，其也可能影響種子的組成；(vi)增加的收獲指數，其表示為可收獲部分(如種子)的產率與總生物量的比值；和(vii)增加的千粒重(TKW)，其是從所計的飽滿種子數和它們的總重量推斷出的。增加的TKW可能源自增加的種子大小和/或種子重量。
以玉米為例，產率的增加可以表現為以下的一個或多個每公頃或每英畝植物數量的增加，每株植物穗數的增加，行數、行粒數、粒重量、千粒重、穗長度/直徑的增加等等。以稻為例，產率的增加可以表現為以下的一個或多個每公頃或每英畝植物的數量，每株植物的圓錐花序數，每個圓錐花序的小穗數，每個圓錐花序的花數，種子飽滿率的增加，千粒重的增加等等。產率的增加也可能產生改變的構造，或者可以作為改變的構造的結果發生。
根據優選的方面，執行本發明的方法產生具有增加的產率(特別是種子產率)的植物。因此，本發明提供了增加植物產率(特別是種子產率)的方法，該方法包括增加植物中YIPPEE樣多肽或其同源物的活性。
由于本發明的轉基因植物具有增加的產率，相對于相應野生型植物在它們生命周期相應階段的生長速率而言，這些植物可能呈現增加的生長速率(在至少它們部分的生命周期中)。增加的生長速率可能是對植物的一個或多個部分(包括種子)特異性的，或者可能基本上遍及整個植物。具有增加生長速率的植物甚至可能呈現早期開花。生長速率的增加可能出現在植物生命周期的一個或多個階段，或者出現在基本上整個植物生命周期的過程中。在植物生命周期的早期階段，生長速率的增長可能表現為增強的活力。生長速率的增加可以改變植物的收獲周期，使植物能夠比其它可能的情況更晚播種和/或更快收獲。如果生長速率充分增加，可能允許播種同種植物物種更多的種子(例如播種和收獲稻類植物，隨后在一個常規的生長期播種和收獲更多的稻類植物)。同樣的，如果生長速率充分地增長，可能允許播種不同植物物種更多的種子(例如播種和收獲稻類植物，隨后，如播種和任選的收獲大豆、馬鈴薯或任何其它適合的植物)。在一些植物的情況下也可能從同一根莖收獲增加的次數。改變植物的收獲周期可能會導致每英畝年生物量產量的增加(這是由于(比方說在一年中)任何特定植物可以生長和收獲次數的增加)。與野生型對應物相比，生長速率的增加還可能使能夠在更廣闊的地域栽培轉基因植物，因為種植農作物的地域限制通常由種植時(早季)或收獲時(晚季)不利的環境條件所決定。如果縮短收獲周期，可以避免這類不利條件。可以通過來自生長曲線的多種參數確定生長速率，這類參數可以是T-Mid(植物達到其最大大小的50％所需時間)和T-90(植物達到其最大大小90％所需時間)等等。
執行本發明的方法賦予植物增加的生長速率。因此，本發明提供了增加植物生長速率的方法，該方法包括增加植物中YIPPEE樣多肽或其同源物的活性。
在植物處于無脅迫條件下，或植物相對于對照植物暴露于多種脅迫下發生產率和/或生長速率的增加。通常植物通過更加緩慢的生長來應答暴露于脅迫。在重度脅迫條件下，植物甚至可以完全停止生長。另一方面，中度脅迫在本文中定義為當植物暴露于此，其不導致植物完全停止生長喪失重新開始生長能力的任何脅迫。由于耕作方法(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)的發展，栽培的農作物植物常常不會遇到重度脅迫。因此，由中度脅迫誘導的受損的生長成為農業中不期望的要素。中度脅迫是植物可能接觸的典型脅迫。這些脅迫可以是植物被暴露于其的日常生物的和/或非生物的(環境的)脅迫。典型的非生物的或環境的脅迫包括由反常的熱或冷/冰凍溫度產生的溫度脅迫；鹽脅迫；水脅迫(干旱或過量的水)。非生物脅迫也可以由化學藥品引起。生物的脅迫一般是由病原體如細菌、病毒、真菌和昆蟲引起的那些脅迫。
可以在任何植物中有利地修飾上述生長特性。
本文所用術語“植物”包括整個植物、植物的祖先和后代以及植物的部分，包括種子、芽、莖、葉、根、花(包括塊莖)以及組織和器官，其中上述的每種(優選在YIPPEE樣基因座)包括目的基因/核酸和/或遺傳修飾。術語“植物”還包括懸浮培養物、愈傷組織、胚、分生區、配子體、孢子體、花粉、和小孢子，同樣其中上述的每種(優選在YIPPEE樣基因座)包括目的基因/核酸和/或遺傳修飾。
在本發明的方法中特別有用的植物包括屬于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，特別是單子葉和雙子葉植物，包括選自如下物種的飼料或飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、喬木或灌木；金合歡屬物種(Acaciaspp.)、槭樹屬物種(Acer spp.)、獼猴桃屬物種(Actinidia spp.)、七葉樹屬物種(Aesculus spp.)、新西蘭貝殼杉(Agathis australis)、Albiziaamara、Alsophila tricolor、須芒草屬物種(Andropogon spp.)、落花生屬物種(Arachis spp.)、檳榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、Astragaluscicer、Baikiaea plurijuga、樺木屬(Betula spp.)、蕓苔屬(Brassica spp.)、木欖(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫鉚(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱纓花屬物種(Calliandra spp.)、大葉茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒屬物種(Capsicum spp.)、決明屬物種(Cassia spp.)、距豌豆(Centroema pubescens)、木瓜屬物種(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffeaarabica)、Colophospermum mopane、變異小冠花(Coronillia varia)、Cotoneaster serotina、山楂屬物種(Crataegus spp.)、香瓜屬物種(Cucumisspp.)、柏木屬物種(Cupressus spp.)、Cyathea dealbata、榅桲(Cydoniaoblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅屬物種(Cymbopogonspp.)、Cynthea dealbata、榅桲(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、大葉骨碎補(Davallia divaricata)、山馬蟥屬物種(Desmodium spp.)、粗糙蚌貝蕨(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、鐮扁豆屬物種(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloapyramidalis、Ehrartia spp.、穇子(Eleusine coracana)、畫眉草屬物種(Eragrestis spp.)、刺桐屬物種(Erythrina spp.)、桉屬物種(Eucalyptusspp.)、Euclea schimperi、Eulalia villosa、蕎麥屬物種(Fagopyrum spp.)、費約果(Feijoa sellowiana)、草莓屬物種(Fragaria spp.)、千斤拔屬物種(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergi、銀杏(Ginkgobiloba)、Glycine javanica、Gliricidia spp、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀樺屬物種(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、巖黃芪屬物種(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黃茅(Heteropogoncontortus)、大麥(Hordeum vulgare)、Hyparrhenia rufa、小連翹(Hypericumerectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭藍(Indigo incarnata)、鳶尾屬物種(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子屬物種(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、Leucaena leucocephala、Loudetia simplex、羅頓豆(Lotonusbainesii)、百脈根屬物種(Lotus spp.)、Macrotyloma axillare、蘋果屬物種(Malus spp.)、Manihot esculenta、紫苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、粉芭蕉(Musa sapientum)、煙草屬物種(Nicotianum spp.)、驢食豆屬物種(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、稻屬物種(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草屬物種(Pennisetumspp.)、Persea gratissima、碧冬茄屬物種(Petunia spp.)、菜豆屬物種(Phaseolus spp.)、檳榔竹(Phoenix canariensis)、Phormium cookianum、石楠屬物種(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松屬物種(Pinusspp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、楊屬物種(Populus spp.)、牧豆樹(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobiumstellatum、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬物種(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhusnatalensis、歐洲醋栗(Ribes grossularia)、茶藨子屬物種(Ribes spp.)、洋槐(Robinia pseudoacacia)、薔薇屬物種(Rosa spp.)、懸鉤子屬物種(Rubus spp.)、柳屬物種(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美紅杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜屬物種(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫蘆茶屬物種(Tadehagi spp.)、落羽松(Taxodiumdistichum)、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、車軸草屬物種(Trifoliumspp.)、小麥屬物種(Triticum spp.)、異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)、越桔屬物種(Vaccinium spp.)、野豌豆屬物種(Vicia spp.)、葡萄(Vitisvinfera)、錐穗沃森花(Watsonia pyramidata)、馬蹄蓮(Zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、莧屬植物、洋薊、蘆筍、椰菜、孢子甘藍、卷心菜、蕓苔、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣綠甘藍、亞麻、羽衣甘藍、小扁豆、油料種子油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、茶樹和藻類等等。根據本發明優選的實施方案，所述植物為農作物植物，如大豆、向日葵、蕓苔、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、馬鈴薯或煙草。進一步優選的植物是單子葉植物，如甘蔗。更優選的植物是谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱或燕麥。
可以通過提高植物中多肽的水平來增加YIPPEE樣多肽的活性。備選地，當YIPPEE樣多肽水平沒有改變，或者甚至當YIPPEE樣多肽水平降低的時候，其活性也可以增加。這種情況出現在多肽固有特性發生改變的時候，例如，通過制備比野生型多肽更具活性的突變體形式。
本文定義的術語“YIPPEE樣多肽或其同源物”指這樣的多肽，其包括(i)推定的鋅結合基序2×CXXC，其中X是任意氨基酸殘基；和(ii)KYKEGK基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和任意的保守的氨基酸取代；和(iii)GRAYLF基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和任意的保守的氨基酸取代。推定的鋅結合基序通常發現2×CXXC在第一個和第二個CXXC之間存在約52個氨基酸殘基的間隔，即CXXC{52個氨基酸}CXXC。術語“任意保守的氨基酸取代”意指任一或多個氨基酸殘基可以被保守的取代代替。在本技術領域可以容易地獲得保守取代表。下表給出保守的氨基酸取代的實例。
表1保守氨基酸取代的實例
可以用本領域內眾所周知的常規技術容易地鑒定“YIPPEE樣多肽或其同源物”。上述定義的基序是高度保守的，因此，本領域的技術人員可以根據這些基序的存在容易地鑒定其它YIPPEE樣序列。
基于與果蠅轉錄因子的同源性發現了由SEQ ID NO1的核酸編碼、SEQ ID NO2所代表的植物YIPPEE樣多肽序列。歸入“YIPPEE樣多肽或其同源物”定義的植物衍生的多肽實例包括所有來自擬南芥(Arabidopsis thalialiana)的At3g08990(SEQ ID NO4)、At3g11230(SEQ IDNO6)、At2g40110(SEQ ID NO8)、At4g27740(SEQ ID NO10)和At5g53940(SEQ ID NO12)；來自馬鈴薯的AB061267(SEQ ID NO14)；玉米中的預測蛋白質AY109711.1(SEQ ID NO16)和AY104347.1(SEQID NO18)；稻中的預測蛋白質NM_196100.1(SEQ ID NO20)、AK121352.1(SEQ ID NO22)和AK109500.1(SEQ ID NO24)。下表展示了上述YIPPEE樣多肽序列與SEQ ID NO2基于整體序列比對的同源性百分比。表中登錄號1到7指蛋白質，其余登錄號指具有給出蛋白質序列預測的相應SEQ ID NO的mRNA。同一性的百分數用NCBI比對程序進行缺省參數的計算得出。
表2基于整體序列比對的YIPPEE樣蛋白質序列與SEQ ID NO2的同源性
應該理解的是，歸入“YIPPEE樣多肽或其同源物”定義的序列不限于由SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22和SEQ ID NO24所代表的序列，而是任何符合以下標準的多肽，所述標準包括(i)推定的鋅結合基序2×CXXC，其中X指任意氨基酸殘基；和(ii)KYKEGK基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；和(iii)GRAYLF基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和可以適用于本發明方法的任意保守的氨基酸取代。當多肽具有至少一種上述(i)到(iii)的基序時，也可以執行本發明的方法。
編碼YIPPEE樣多肽或其同源物的核酸可以是任何天然的或合成的核酸。以上定義的YIPPEE樣多肽或其同源物是由YIPPEE樣核酸/基因編碼的。因此，本文定義的術語“YIPPEE樣核酸/基因”是編碼如上定義的YIPPEE樣多肽或其同源物的任何核酸/基因。YIPPEE樣核酸的實例包括SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21和SEQ ID NO23中任一所代表的那些序列。YIPPEE樣核酸/基因及其變體可能適于實施本發明的方法。YIPPEE樣核酸/基因的變體包括YIPPEE樣核酸/基因的部分和/或能與YIPPEE樣核酸/基因雜交的核酸。
本文定義的術語“部分”指包括至少249個核苷酸的DNA片段，并且該部分編碼包含下述的任一或多個(優選所有)基序的多肽(i)推定的鋅結合基序2×CXXC，其中X指任意氨基酸殘基；(ii)KYKEGK基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；(iii)GRAYLF基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代。可以，例如，通過在YIPPEE樣核酸中產生一個或多個缺失來制備部分。部分可以以分離的形式應用，或者它們可以與其它編碼(或非編碼)序列融合以，例如，產生組合多種活性的蛋白質。當與其它編碼序列融合時，翻譯產生的多肽產物可能大于預測的YIPPEE樣片斷。優選地，功能部分是由以下任一所代表核酸的部分SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21和SEQ ID NO23。
另一YIPPEE樣核酸/基因變體是在降低的嚴格條件下(優選在嚴格條件下)能夠與上文所定義的YIPPEE樣核酸/基因雜交的核酸，該雜交序列編碼包含下述的任一或多個(優選所有)基序的多肽(i)一個推定的鋅結合基序2×CXXC，其中X指任意氨基酸殘基；(ii)KYKEGK基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；(iii)GRAYLF基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代。優選地，雜交序列能與由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21和SEQID NO23所代表的任何核酸序列雜交，或與上文所定義的上述核酸序列的任何部分雜交。
本文定義的術語“雜交”指其中基本同源互補的核酸序列彼此退火的過程。雜交過程能夠完全在溶液中發生，即互補的核酸都在溶液中。雜交過程也可以在這種情況下進行，即互補核酸之一固定于基質上，如磁珠、瓊脂糖珠或任何其它樹脂上。此外，雜交過程也可以如此進行，即其中互補核酸之一固定在固相支持物如硝酸纖維素或尼龍膜上，或者如用照相平板印刷固定在硅質玻璃支持物上(后者稱之為核酸陣列或微陣列，或稱之為核酸芯片)。為了使雜交發生，通常使核酸分子熱變性或化學變性，以使雙鏈解鏈成兩條單鏈，和/或除去單鏈核酸中的發夾結構或其它二級結構。雜交的嚴格性受諸如溫度、鹽濃度、離子強度和雜交緩沖液組成等條件的影響。
在核酸雜交實驗(如Southern和Northern雜交)的情況中，“嚴格雜交條件”和“嚴格雜交洗滌條件”依賴于序列，并且在不同的環境參數下不同。熟練的技術人員知道可以在雜交和洗滌過程中改變的多種參數，從而保持或者改變嚴格條件。
Tm是在確定的離子強度和pH值下，50％的靶序列與完全配對的探針雜交的溫度。Tm依賴于溶液條件和探針的堿基組成及長度。例如，較長的序列在較高溫度下特異性雜交。在低于Tm值16℃到32℃獲得最大雜交率。在雜交溶液中存在一價陽離子會減少兩核酸鏈之間的靜電排斥作用，從而促進雜合體形成；當鈉濃度高達0.4M時，這一作用明顯。每個百分點的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度降低0.6到0.7℃，加入50％甲酰胺使雜交在30到45℃完成，盡管這將降低雜交率。堿基對錯配降低雜交率和雙鏈體的熱穩定性。平均而言，對于大的探針，每個百分點堿基錯配使Tm值下降約1℃。Tm值可以用依賴于雜合體類型的下列方程式計算1、DNA-DNA雜合體(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138267-284，1984)Tm＝81.5℃+16.6×log[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×[Lc]-1-0.61×％甲酰胺2、DNA-RNA或RNA-RNA雜合體
Tm=79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc3、寡DNA或寡RNAd雜合體＜20個核苷酸Tm=2(ln)20-35個核苷酸Tm=22+1.46(ln)a或對于其它一價陽離子，但是僅在0.01-0.4M范圍內精確。
b僅對于在30％到75％范圍內的％GC精確。
cL=雙鏈體的堿基對長度。
d寡，寡核苷酸；ln，引物的有效長度＝2×(G/C數)+(A/T數)。
注釋對于每1％甲酰胺，Tm值降低約0.6到0.7℃，而6M尿素的存在可使Tm值降低約30℃。
雜交特異性通常是雜交后洗滌的函數。為了除去非特異雜交產生的背景，用稀釋的鹽溶液洗滌樣品。這類洗滌的關鍵因素包括最終洗滌溶液的離子強度和溫度鹽濃度越低、洗滌溫度越高，洗滌的嚴格性就越高。洗滌條件通常在等于或低于雜交嚴格性條件下進行。一般地，如上設置適用于核酸雜交測定或基因擴增檢測操作的嚴格條件。也可以選擇更高或更低的嚴格性條件。通常，對于在確定的離子強度和pH值下的特定序列，選擇比熱解鏈溫度(Tm)低50℃的低嚴格條件。中等嚴格條件是溫度比Tm低20℃，高嚴格條件是溫度比Tm低10℃。例如，嚴格條件是至少像如條件A-L一樣嚴格；降低的嚴格條件是至少像如條件M-R一樣嚴格。可以通過許多已知技術中的任一來控制非特異性結合，所述技術諸如，例如用含蛋白質的溶液封閉膜，在雜交緩沖液中添加異源RNA、DNA和SDS，和用RNA酶處理。在以下表3中列出雜交和洗滌條件的實例。
表3雜交和洗滌條件的實例
“雜交長度”是雜交核酸的預期長度。當已知序列的核酸雜交時，可以通過比對序列及鑒別本文所述的保守區域來確定雜合體長度。
在雜交和洗滌緩沖液中，可以用SSPE(1×SSPE是0.15M NaCI，10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1×SSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉)；雜交完成后洗滌15分鐘。雜交和洗滌可以另外地包括5×Denhardt's試劑、0.5-1.0％SDS、100μg/ml變性的片段化的鮭精DNA、0.5％焦磷酸鈉、和高達50％的甲酰胺。
*Tb-Tr對于預期長度小于50個堿基對的雜合體，雜交溫度應該比雜合體的解鏈溫度Tm低5-10℃；根據上述方程式確定Tm。
±本發明還包括以PNA或修飾的核酸代替任一或多個DNA或RNA雜交配偶體。
為了定義嚴格性水平，可以參考Sambrook等人(2001)的分子克隆實驗室手冊，第三版，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約，或者CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)。
YIPPEE樣核酸或其變體可以來自任何天然或人工的來源。核酸/基因或其變體可以分離自微生物來源(如細菌、酵母或真菌)，或分離自植物、藻類或動物(包括人類)。可以通過仔細的人為操作在組成和/或基因組環境上修飾所述核酸的天然形式。優選植物來源的核酸，無論來源于同一植物物種(例如對于其被導入的物種而言)或來源于不同植物物種。可以從雙子葉物種，優選從十字花科，更優選從擬南芥分離所述核酸。更優選地，從擬南芥中分離的YIPPEE樣核酸表示為SEQ ID NO1，并且YIPPEE樣氨基酸序列表示為SEQ ID NO2。
可以通過導入遺傳修飾(優選在YIPPEE樣基因座)提高YIPPEE樣多肽或其同源物的活性。本文所定義的基因座意指基因組區，其包括目的基因和編碼區上游或下游的10KB。
可以通過任一(或多個)如下方法導入遺傳修飾，所述方法包括TDNA激活、TILLING、定點誘變、定向進化、同源重組或通過在植物中導入和表達編碼YIPPEE樣多肽或其同源物的核酸。導入遺傳修飾之后的步驟是選擇活性增加的YIPPEE樣多肽，其活性的增加使植物具有改良的生長特性。
T-DNA激活標記(Hayashi等人Science(1992)1350-1353)包括將通常含有啟動子(也可以是翻譯增強子或內含子)的T-DNA插入在目的基因的基因組區或基因編碼區上游或下游10KB，從而在構型上使啟動子能夠指導靶向基因的表達。通常天然啟動子對靶基因表達的調控被破壞，基因由新導入的啟動子控制。啟動子一般包含于T-DNA中。，例如，通過農桿菌(Agrobacterium)感染將此T-DNA隨機插入植物基因組并導致在插入T-DNA附近的基因過表達。得到的轉基因植物由于導入的啟動子附近基因過表達而表現出顯性表型。導入的啟動子可以是任意能夠在所希望的生物體內(在本案中是植物)指導基因表達的啟動子。例如，組成型的、組織偏好的、細胞類型偏好的和誘導型的啟動子都適用于T-DNA激活。
也可以通過TILLING(定點誘導的基因組局部突變)技術將遺傳修飾導入YIPPEE基因座。這是一種誘變技術，其用于產生和/或鑒定、及最后分離誘變的能呈現YIPPEE樣活性的YIPPEE樣核酸變體。TILLING還允許選擇攜帶此種突變變體的植物。這些突變變體甚至可能比其天然形式基因呈現更高的YIPPEE樣活性。TILLING結合了高密度誘變和高通量篩選方法。TILLING一般遵循的步驟有(a)EMS誘變(Redei和Koncz，1992；Feldmann等人，1994；Lightner和Caspar，1998)；(b)DNA制備和個體合并；(c)目的區域的PCR擴增；(d)變性和退火以形成雜雙鏈體；(e)DHPLC，其中庫中存在的雜雙鏈體會在色譜圖上檢測到額外的峰；(f)突變個體的鑒定；和(g)突變PCR產物的測序。TILLING的方法是本領域內眾所周知的(McCallum Nat Biotechnol.2000 Apr；18(4)455-7，由Stemple綜述，2004(TILLING-a high-throughput harvest for functional genomics.Nat Rev Genet.2004 Feb；5(2)145-50.))。
定點誘變可用于產生YIPPEE樣核酸或其部分的變體。可以通過幾種方法來完成定點誘變，最常見的是基于PCR的方法(current protocols inmolecular biology.Wiley編輯http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。
定向進化也可以用于產生YIPPEE樣核酸的變體。這包括DNA改組的重復，繼之以適當篩選和/或選擇，以產生編碼具有修飾的生物活性多肽的YIPPEE樣核酸的變體或其部分的變體(Castle等人，(2004)Science304(5674)1151-4；美國專利5,811,238和6,395,547)。
TDNA激活、TILLING、定向進化和定點誘變是能產生新的等位基因和YIPPEE樣變體的技術的實例。
同源重組允許向基因組中的指定選擇位置導入所選的核酸。同源重組是生物科學中常規使用的標準技術，其用于低等有機體如酵母或小立碗蘚(physcomitrella)。在植物中執行同源重組的方法已經不僅在模式植物中被描述(Offringa等人Extrachromosomal homologous recombination andgene targeting in plant cells after Agrobacterium-mediated transformation.1990EMBO J.1990Oct；9(10)3077-84)，而且也在農作物植物，如稻中被描述(Terada R，Urawa H，Inagaki Y. Tsugane K，Iida S.Efficient genetargeting by homologous recombination in rice.Nat Biotechnol.2002.Iidaand TeradaA tale of two integrations，transgene and T-DNAgenetargeting by homologous recombination in rice.Curr Opin Biotechnol.2004 Apr；15(2)132-8)。所靶向的核酸(其可能是上文中定義的YIPPEE樣核酸或其變體)不需靶向YIPPEE樣基因座，但是可以被導入例如高表達的區域。所靶向的核酸可以是改良的等位基因，其用于替換內源基因或額外引入到內源基因中。
根據本發明的優選實施方案，通過在植物中導入和表達編碼YIPPEE樣多肽或其同源物的核酸，可以改良植物的生長特性。
導入遺傳修飾(在本案中不需導入YIPPEE樣基因座中)的優選方法是在植物中導入和表達編碼YIPPEE樣多肽或其同源物的核酸。上述YIPPEE樣多肽或其同源物包含(i)推定的鋅結合基序2×CXXC，其中X指任意氨基酸殘基；和(ii)KYKEGK基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；和(iii)GRAYLF基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代。導入植物的核酸可以是全長的核酸或者是上述定義的部分或雜交序列。
蛋白質的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶，其相對于所討論的未修飾蛋白質具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且具有與其衍生自的未修飾形式蛋白質相似的生物學活性和功能活性。為了產生這樣的同源物，蛋白質的氨基酸由具有相似性質(如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或打破α螺旋結構或β片層結構的傾向)的其它氨基酸所替換。保守取代表是本領域內眾所周知的(例如見Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company和上述表1)。
根據本發明優選的方面，同源物與SEQ ID NO2所代表的氨基酸序列有至少45％的序列同一性。通過序列比對可以容易地確定多肽是否與SEQID NO2所代表的氨基酸序列有至少45％的序列同一性。用于比較的序列比對方法是本領域內眾所周知的，這些方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP應用Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.48443-453，1970)來查找兩個全序列的比對，使配對數最大化和空位數最小化。BLAST算法計算序列同一性的百分比，并對兩序列之間的相似性進行統計分析。執行BLAST分析的軟件可從生物技術信息國家中心公開地獲得。通過查詢序列(優選蛋白質序列)與已知YIPPEE樣蛋白質序列的比對(見例如在圖1所示的比對)，可以容易地鑒別與SEQ ID NO2所代表的氨基酸序列有至少45％的序列同一性的YIPPEE樣多肽或其同源物。可以使用例如VNTI AlignX多重比對程序進行查詢序列的比對(與已知的YIPPEE樣序列)，其基于改良的clustal W算法(InforMax，Bethesda，MD，http://www.informaxinc.com)，帶有空位開放罰分為10以及空位延伸為0.05的缺省設置。
術語“同源物”也包括兩種具體形式的同源物，其包括直系同源序列和旁系同源序列，其涵蓋用于描述基因祖先關系的進化概念。術語“旁系同源”涉及在物種基因組內部的基因復制產生的旁系基因。術語“直系同源”涉及由于物種形成產生的不同有機體中的同源基因。
例如可以通過所謂的交互(reciprocal)blast搜索容易地找到例如在單子葉植物種中的直系同源物。這可以通過使用所研究序列(例如SEQ IDNO1或SEQ ID NO2)針對任何序列數據庫(諸如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov找到的公共可獲得的NCBI數據庫)進行一次blast而實現。例如，如果尋找稻中的直系同源物，對研究序列的blast應該在可從NCBI獲得的針對稻(Oryza sativa)日本晴(Nipponbare)的28，469個全長cDNA克隆中進行。當從核苷酸開始時可使用具有標準缺省值的BLASTn或tBLASTX，或當從蛋白質開始時可使用具有標準缺省值的BLASTP或TBLASTN。Blast結果可以被過濾。接著使用過濾的結果或者未過濾的結果中的全長序列針對所研究序列源自的生物體的序列進行反向blast(二次blast)。然后比較第一次和第二次blast的結果。例如，當所述二次blast結果給出與YIPPEE樣核酸或YIPPEE樣多肽具有最高相似性序列時，如果生物體之一是擬南芥，那么找到了旁系同源物。大家族的情況下可以使用Clustal W，繼之以鄰近連接樹來輔助聚類可視化。
同源物可能是蛋白質的“取代變體”的形式，即在氨基酸序列中至少有一個殘基被除去，并且在這一位置插入不同的殘基。氨基酸取代通常是單個殘基的取代，但是視施加于多肽的功能性限制而定也可能是成簇取代；插入通常在1到10個氨基酸殘基數量級。優選地，氨基酸取代包括保守的氨基酸取代。
同源物也可能是蛋白質的“插入變體”的形式，即在蛋白質的預定位置導入一個或多個氨基酸殘基。插入可以包括氨基端和/或羧基端的融合，以及單個或多個氨基酸的內部序列插入。一般氨基酸序列內部的插入將小于氨基或羧基端的融合，數量級在約1到10個殘基。氨基或羧基端融合蛋白質或肽的實例包括在酵母雙雜交系統中應用的轉錄激活因子的結合結構域或激活結構域、噬菌體外殼蛋白質、(組氨酸)6標簽、谷胱甘肽S-轉移酶標簽、蛋白質A、麥芽糖結合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag.100表位、c-myc表位、FLAG表位、lacZ、CMP(鈣調蛋白結合肽)、HA表位、蛋白質C表位和VSV表位。
蛋白質“缺失變體”形式的同源物特征在于從蛋白質中除去一個或多個氨基酸。
可通過本領域內眾所周知的肽合成技術，如固相肽合成法等，或通過重組DNA操作容易地得到蛋白質的氨基酸變體。用于產生蛋白質的取代、插入或缺失變體的DNA序列操作方法是本領域內眾所周知的。例如，本領域內的技術人員熟知在DNA預定位置產生取代突變的技術，其包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定點誘變(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介導的定點誘變或其它定點誘變方法。
YIPPEE樣多肽或其同源物可以是衍生物。“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶，與天然產生形式的蛋白質，例如SEQ ID NO2所代表的氨基酸序列相比，其可以包括取代、缺失或添加的天然的和非天然產生的氨基酸殘基。蛋白質的“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶，與天然產生形式多肽的氨基酸序列相比，其可以包括天然產生的改變的、糖基化、酰基化的氨基酸殘基或非天然產生的氨基酸殘基。衍生物還可以包括相對于其源自的氨基酸序列的一個或多個非氨基酸取代基(例如共價或非共價地結合于氨基酸序列的報告分子或其它配體，例如與之結合有利于衍生物檢測的報告分子)，以及相對于天然產生蛋白質的氨基酸序列而言非天然產生的氨基酸殘基。
YIPPEE樣多肽或其同源物可能由YIPPEE樣核酸/基因的選擇性剪接變體編碼。本文所用的術語“選擇性剪接變體”包括其中選擇的內含子和/或外顯子已被切除、替換或添加的核酸序列的變體。這樣的變體保持了蛋白質的生物活性，這可能通過有選擇地保留蛋白質的功能性片段來實現。這樣的剪接變體可以是天然的或人工的。產生這類剪接變體的方法是本領域內眾所周知的。優選的剪接變體是SEQ ID NO1代表的核酸的剪接變體。更優選編碼包含下列任一或多個(優選所有)基序的多肽的剪接變體(i)推定的鋅結合基序2×CXXC，其中X指任意氨基酸殘基；(ii)KYKEGK基序，其允許一個氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；(iii)GRAYLF基序，其允許一個氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代。
同源物還可以由編碼YIPPEE樣多肽或其同源物的核酸的等位基因變體所編碼，優選SEQ ID NO1代表的核酸的等位基因變體。更優選由等位基因變體編碼的，包含下列任一或多個(優選包含所有)基序的多肽(i)推定的鋅結合基序2×CXXC，其中X指任意氨基酸殘基；(ii)KYKEGK基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；(iii)GRAYLF基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代。等位基因變體天然存在，并且這些天然等位基因的用途包含于本發明的方法中。等位基因變體包括單核苷酸多態性(SNP)，以及小型插入/缺失多態性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL在大多數生物體天然存在的多態性品系中形成最大的一組序列變體。
根據本發明的優選方面，YIPPEE樣核酸或其變體的表達有所提高或增加。獲得提高或增加的基因或基因產物表達的方法在本領域內有充分的記錄，其包括，例如由適當的啟動子驅動的過表達、轉錄增強子或翻譯增強子的使用。可以將用作啟動子或增強子元件的分離的核酸導入非異源形式多核苷酸的適當位置(一般是上游)，從而上調YIPPEE樣核酸或其變體的表達。例如，可以通過突變、缺失和/或取代，體內地改變內源啟動子(見Kmiec，美國專利No.5,565,350；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或者將分離的啟動子在本發明基因的適當方向和距離導入植物細胞中，從而控制基因的表達。
如果期望多肽表達，通常要在多肽編碼區域的3’-末端包括多腺苷酸化區域。多腺苷酸化區域可以源自天然基因、多種其它植物基因或T-DNA。例如，加入的3’末端序列可以源自胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因、或備選地源自其它植物基因、或次優選地源自任何其它真核基因。
也可以在5’非翻譯區或部分編碼序列的編碼序列中加入內含子序列，來增加在胞質中累積的成熟信使的數量。已顯示，在植物和動物表達構建體的轉錄單位中包含的可剪接的內含子均可以在mRNA和蛋白質水平增加高達1000倍的基因表達，Buchman和Berg，Mol.Cell biol.84395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.11183-1200(1987)。通常這種內含子被放置在轉錄單位5’末端附近時，其提高基因表達的作用達到最大。玉米內含子Adh1-S內含子1、2和6，Bronze-1內含子的使用是本領域公知的。通常見The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot編輯，Springer，N.Y.(1994)。
本發明還提供遺傳構建體和載體，以促進用于本發明方法中的核酸序列的導入和/或表達。
因此，提供的基因構建體包含(i)YIPPEE樣核酸或其變體；(ii)一個或多個能驅動(i)中核酸序列表達的控制序列；和任選的(iii)轉錄終止序列。
可以使用本領域技術人員熟知的重組DNA技術構建用于本發明方法的構建體。可以將基因構建體插入可商購的，適合于轉化進入植物和在轉化的細胞中表達目的基因的載體中。
使用包括目的序列(即YIPPEE樣核酸或其變體)的載體轉化植物。將目的序列有效連接于一個或多個控制序列(至少連接于啟動子)。術語“調控元件”、“控制序列”和“啟動子”在本文中都可交換的使用，從廣義上是指能夠影響其連接序列表達的調控核酸序列。上述術語包括源自典型真核生物基因組基因(包括具有或沒有CCAAT盒序列的TATA盒，其對于精確的轉錄起始是必需的)的轉錄調控序列，以及另外的調控元件(即上游激活序列、增強子和沉默子)，其通過應答發育刺激和/或外部刺激或通過組織特異的方式改變基因表達。該術語還包括了經典原核生物基因的轉錄調控序列，在此情況下可以包括-35盒序列和/或-10盒轉錄調控序列。術語“調控元件”也包含合成的融合分子或衍生物，其賦予、激活或提高細胞、組織或器官中核酸分子的表達。本文所用的術語“有效連接”指在啟動子序列和目的基因之間的功能性連接，以使啟動子序列能起始目的基因的轉錄。
有利地，可以使用任意類型的啟動子驅動核酸序列的表達。啟動子可以是誘導型啟動子，即應答發育、化學、環境或物理的刺激，具有誘導的或增加的轉錄起始。誘導型啟動子的實例是脅迫誘導型啟動子，即當植物暴露于多種脅迫條件下時激活的啟動子。另外或備選的，所述啟動子可以是組織偏好的啟動子，即能夠在某些組織，如在葉、根、種子等組織中優先地起始轉錄。能夠僅在某些組織中起始轉錄的啟動子在本文中稱為“組織特異的”。
優選的，YIPPEE樣核酸或其變體有效的連接于組成型啟動子。組成型啟動子在大多數(但無需全部)生長和發育階段有轉錄活性，并且是基本上普遍表達的。優選的組成型啟動子是GOS2啟動子(源自稻)(SEQ ID NO25)。應該明確的是本發明的應用并不限于SEQ ID NO1代表的YIPPEE樣核酸，也不限于由GOS2啟動子驅動的YIPPEE樣核酸的表達。其它組成型啟動子的實例顯示于以下表4中。
表4組成型啟動子的實例
任選的，還可以在導入植物的構建體中使用一個或多個終止子序列。術語“終止子”包括控制序列，其為位于轉錄單位末端的DNA序列，傳遞信號引發原始轉錄本的3’加工和多腺苷酸化以及轉錄的終止。另外的調控元件可以包括轉錄和翻譯的增強子。本領域的那些技術人員將知道適合用于進行本發明的終止子和增強子的序列。這種序列為本領域技術人員所公知或者可以容易地獲得。
本發明的遺傳構建體還包括在特定細胞類型中維持和/或復制所需的復制序列的起點。一個實例是當需要將遺傳構建體作為附加型遺傳元件(如質粒或粘粒分子)在細菌細胞中維持時。優選的復制起點包括(但不限于)f1-ori和colE1。
遺傳構建體可以任選地包括可選擇的標記基因。如本文所用，術語“可選擇的標記基因”包括賦予細胞表型的任意基因，該基因在細胞中的表達有利于鑒定和/或選擇經本發明的核酸構建體轉染或轉化的細胞。適當的標記可以選自帶有抗生素或除草劑抗性的標記。含重組DNA的細胞將因而能夠在殺死非轉化細胞濃度的抗生素或除草劑存在下存活。可選擇的標記基因的實例包括提供除草劑Basta抗性的bar基因；賦予針對抗生素卡那霉素抗性的npt基因；賦予潮霉素抗性的hpt基因。可視的標記，如綠色熒光蛋白(GFP，Haseloff等人，1997)，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或螢光素酶也用作可選擇的標記。更多適當的可選擇標記基因的實例包括氨芐青霉素抗性(Ampr)，四環素抗性基因(Tcr)，膦絲菌素抗性基因，潮霉素抗性基因和氯霉素乙酰轉移酶(CAT)基因等等。
本發明還包括由本發明方法可獲得的植物。本發明因此提供由本發明方法可獲得的植物，該植物中被導入本文的YIPPEE樣核酸或其變體，和/或該植物優選在YIPPEE樣基因座具有遺傳修飾。
本發明還提供產生具有改良生長特性的轉基因植物的方法，其包括在植物中導入和表達YIPPEE樣核酸或其變體，和/或包括優選地在YIPPEE樣基因座導入遺傳修飾。
更具體地，本發明提供產生具有改良生長特性的轉基因植物的方法，該方法包括(i)向植物或植物細胞中導入YIPPEE樣核酸或其變體，和/或優選地在YIPPEE樣基因座導入遺傳修飾；和(ii)在促進植物生長和發育的條件下培養植物細胞。
可以將核酸直接導入植物細胞或植物本身(包括導入組織、器官或植物的任何其它部分)。根據本發明的優選方面，優選通過轉化將核酸導入植物。
本文所指術語“轉化”包含將外源多核苷酸轉移進宿主細胞，不考慮轉移所用的方法。由器官發生或者胚胎發生的能夠隨即克隆增殖的植物組織都可以使用本發明的遺傳構建體轉化并從其再生整個植物。具體的組織選擇將因可提供和最適于轉化的具體物種的克隆增殖系統而改變。示例性的靶組織包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子、愈傷組織、存在的分生組織(例如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)，和誘導的分生組織(例如子葉分生組織和下胚軸分生組織)。可以將多核苷酸瞬時的或穩定的導入宿主細胞，并且可以，例如作為質粒保持非整合的狀態。備選地，其可以整合進入宿主基因組。得到的轉化植物細胞可以接著用于以本領域技術人員熟知的方式再生為轉化的植物。
植物物種的轉化目前是一種相當常規的技術。有利地，可以使用幾種轉化方法的任一向適當的祖先細胞導入目的基因。轉化方法包括用脂質體、電穿孔、增強游離DNA攝取的化學品、直接向植物注射DNA、粒子槍轟擊、用病毒或花粉轉化和顯微投影(microprojection)。方法可以選自用于原生質體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等人，1882，Nature296，72-74；Negrutiu I.等人，June1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生質體的電穿孔法(Shillito R.D.等人，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；植物材料的顯微注射(Crossway A.等人，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)DNA或RNA包被的粒子轟擊(Klein T.M.等人，1987，Nature327，70)；(非整合的)病毒感染等等。優選使用任何通過農桿菌介導轉化產生表達YIPPEE樣基因/核酸的轉基因稻的熟知方法，例如在任何以下文獻中描述的方法公開的歐洲專利申請EP1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人(PlantJ.6(2)271-282，1994)，其公開的內容如同其陳述的全部內容那樣并入本文作為參考。至于谷物轉化，優選的方法如Ishida等人(Nat.Biotechnol.1996，14(6)745-50)或Frame等人(Plant Physiol.2002，129(1)13-22)中所述，其公開的內容如同其陳述的全部內容那樣并入本文作為參考。
通常在轉化以后，選出存在一個或多個標記的植物細胞或細胞組中，所述標記由與目的基因共轉移的植物可表達基因編碼，繼之轉化的材料再生成整個植物。
DNA轉移和再生之后，可評估假定的轉化植物，例如用Southern分析目的基因的存在、拷貝數和/或基因組組成。備選的或額外的，可用Northern和/或Western分析監測新導入基因的表達水平，這兩種技術都是本領域內普通技術人員熟知的。
產生的轉化植物可以通過多種方式繁殖，如用克隆繁殖或經典的育種技術。例如，第一代(或T1)轉化的植物可自交得到純合的第二代(或T2)轉化體，T2植物進一步通過經典育種技術繁殖。
產生的轉化生物體可以有多種形式。例如，它們可以是轉化細胞和非轉化細胞的嵌合體；克隆的轉化體(例如經過轉化包含表達盒的所有細胞)；轉化和非轉化組織的嫁接體(例如在植物中，轉化的根莖嫁接到非轉化的接穗上)。
本發明顯然延及由本文所述方法產生的任何植物細胞或植物，以及所有植物的部分和其無性繁殖體。本發明還涵蓋由任意上述方法產生的原代轉化或轉染的細胞、組織、器官或整個植物的后代，所述后代的唯一要求是與本發明方法產生的親本呈現同樣的基因型和/或表型特性。本發明也包括含有分離的YIPPEE樣核酸或其變體的宿主細胞。本發明優選的宿主細胞是植物細胞。本發明也延及植物可收獲的部分，例如，但不限于種子、葉、果實、花、莖培養物、根莖、塊莖和球莖。
本發明還包括YIPPEE樣核酸或其變體的用途和YIPPEE樣多肽或其同源物的用途。
一種這樣的用途涉及改良植物的生長特性，特別是改良產率/生物量，尤其是種子產率。種子產率可能包括如下的一個或多個增加的(飽滿)種子數、增加的種子重量、增加的收獲指數等等。
可以在育種程序中使用YIPPEE樣核酸或其變體，或者YIPPEE樣多肽或其同源物，其中鑒定可以遺傳地連接于YIPPEE樣基因或其變體的DNA標記。可以使用YIPPEE樣核酸/基因或其變體，或者YIPPEE樣多肽或其同源物界定分子標記。接著可以將此DNA或蛋白質標記在育種程序中使用，以選擇具有改良的生長特性的植物。例如，YIPPEE樣基因或其變體可以是任意一個由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21和SEQ ID NO23代表的核酸。
YIPPEE樣核酸/基因的等位基因變體也可以用于標記輔助的育種程序。這類育種程序有時需要使用，例如EMS誘變，通過植物誘變處理導入等位基因變體；備選的，此程序可以以收集無意產生的所謂“天然”起源的等位基因變體開始。然后通過例如PCR鑒定等位基因變體。隨后是選擇步驟用以選擇所討論序列的較好等位基因變體，所述等位基因變體賦予植物改良的生長特性。一般通過監測含有所研究序列的不同等位基因變體植物的生長行為來進行選擇，所述研究序列的不同等位基因變體是例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21和SEQ ID NO23中任一的不同等位基因變體。可以在溫室或田地中監測生長行為。更多任選的步驟包括，將經鑒定含有較好等位基因變體的植物與另一植物雜交。例如，可使用這種方法產生目的表型特征的組合。
YIPPEE樣核酸或其變體還可以作為探針，用于對其為基因一部分的基因進行遺傳和物理的作圖，以及作為那些基因連鎖性狀的標記。這些信息可以在植物育種中使用，以得到具有所希望表型的品系。YIPPEE樣核酸或其變體的這類應用僅需要至少15個核苷酸長的一段核酸序列。YIPPEE樣核酸或其變體也可以用作限制性片段長度多態性(RFLP)標記。可用YIPPEE樣核酸或其變體探測限制酶切消化的植物基因組DNA的Southern印跡(Maniatis)。隨后使用計算機程序如MapMaker(Lander等人，1987)對產生的帶型進行遺傳分析，以構建遺傳圖譜。此外，可以使用核酸在含有一組個體的限制性內切酶處理的基因組DNA中探測Southern印跡，所述一組個體為代表明確的遺傳雜交的親本和子代的一組個體。DNA多態性的分離被記錄并用于計算在先前用此群體獲得的遺傳圖譜中YIPPEE樣核酸或其變體的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32314-331)。
在遺傳作圖中使用的植物衍生探針的產生和用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 437-41中。很多出版物中描述過用上述方法或其變通形式對特定cDNA克隆進行遺傳作圖。例如，可以使用F2雜交群體、回交群體、隨機交配群體、近親同基因系和其它個體組作圖。這類方法是本領域技術人員眾所周知的。
核酸探針也可以用于物理作圖(即在物理圖譜上安置序列；見Hoheisel等人InNon-mammalian Genomic AnalysisA Practical Guide，Academicpress1996，第319-346頁，及其中引用的參考文獻)。
在另一個實施方案中，核酸探針用于直接熒光原位雜交(FISH)作圖(Trask(1991)Trends Genet.7149-154)盡管目前FISH作圖的方法傾向用于大的克隆(幾個到幾百個KB；見Laan等人(1995)Genome Res.513-20)，但是靈敏性的提高允許在FISH作圖中應用較短的探針。
用于遺傳和物理作圖的多種基于核酸擴增的方法可以使用所述核酸進行。實例包括等位基因特異性擴增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med1195-96)PCR擴增片段的多態性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics16325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等人(1988)Science2411077-1080)、核苷酸延伸反應(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.183671)、放射雜交作圖(Walter等人(1997)Nat.Genet.722-28)和Happy作圖(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.176795-6807)。為實施這些方法，使用核酸序列設計和產生用于擴增反應或引物延伸反應的引物對。這類引物的設計是本領域內技術人員眾所周知的。使用基于PCR的遺傳作圖的方法，可能需要鑒定跨越相應于本發明核酸序列區域作圖的親本之間DNA序列的差異。然而，這對作圖方法通常不是必要的。
還發現YIPPEE樣核酸或其變體，或者YIPPEE樣多肽或其同源物作為生長調節物的用途。由于這些分子已顯示在促進植物生長特性中有用，所以它們也是有用的生長調節物，如除草劑或生長刺激物。因此，本發明提供用作生長調節物的組合物，其包括YIPPEE樣核酸/基因或其變體或者YIPPEE樣多肽或其同源物、以及適當的載體、稀釋劑或賦形劑。
根據本發明的方法得到如前所述具有改良生長特性的植物。這些有利的生長特性還可以組合其它經濟上有利的性狀，如進一步提高產率的性狀、對多種脅迫的耐受性、改變各種構造特征和/或生化和/或生理學特征的性狀。
現參考以下附圖描述本發明，其中圖1顯示幾種植物YIPPEE樣多肽的多重比對。推定的鋅結合基序2×CXXC中的半胱氨酸殘基用粗體表示，其中X可以是任意氨基酸。框中為KYKEGK基序和GRAYLF基序。At表示擬南芥。
圖2顯示在GOS2啟動子(內參PRO0129)控制下在稻中表達擬南芥YIPPEE樣(內參CDS1522)的二元載體。
圖3詳述了用于執行本發明方法的序列的實例。
實施例現參考以下實施例描述本發明，所述實施例僅意在舉例說明。
DNA操作除非另外說明，重組DNA技術根據描述于(Sambrook等人(2001)分子克隆實驗室手冊，第三版，冷泉港實驗室出版，CSH，紐約或者Ausubel等人(1994)，分子生物學最新指南的第一卷和第二卷)的標準方法執行。植物分子操作的標準材料和方法由R.D.D.Croy描述于PlantMolecular Biology Labfase(1993)由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
實施例1基因克隆使用擬南芥幼苗cDNA庫(Invitrogen，Paisley，UK)作為模板通過PCR擴增擬南芥YIPPEE樣基因(CDS1522)。從幼苗提取的RNA經反轉錄后，將cDNA克隆進pCMV Sport6.0中。該庫平均插入大小為1.5kb，并且原始克隆數的數量級在1.59×107cfu。在6×1011cfu/ml的第一次擴增之后，確定原始滴度為9.6×105cfu/ml。提取質粒之后，將200ng模板用于50μlPCR混合物中。PCR擴增所用引物(其包括Gateway重組的AttB位點)為prm03196(正義，起始密碼子用粗體表示，AttB1位點用斜體表示5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGCTGTCGGAGATGAT-3’)和prm03199(反義，互補的，終止密碼子用粗體表示，AttB2位點用斜體表示5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAATCAAGCATCATCTCCATCACTAAC3’)。在標準條件下使用Hifi Taq DNA聚合酶進行PCR。同樣用標準方法擴增和純化366bp的PCR片段。接著進行Gateway過程的第一步，BP反應，在此期間將PCR片段與pDONR201質粒體內重組以產生(根據Gateway術語)“進入(entry)克隆”，p3956。作為Gateway技術部分的質粒pDONR201購自Invitrogen。
實施例2載體構建接著，將進入克隆p3956與用于稻轉化的指定載體p0640一起被用于LR反應。此載體在T-DNA邊界內包含以下部分作為功能性元件植物可選擇的標記；可篩選的標記表達盒；旨在與已克隆到進入克隆中的目的序列進行體內重組的LR的Gateway表達盒。用于組成型表達的稻GOS2啟動子(PRO0129)在此Gateway盒的上游(De Pater等人，Plant J.1992Nov；2(6)837-44)。
LR重組步驟之后，將產生的表達載體(圖2)轉化進入農桿菌菌株LBA4044，隨后轉化進入稻類植物。使轉化的稻類植物生長并隨后檢測實施例3中描述的參數。
實施例3評估和結果大約產生了15到20個獨立的T0稻類轉化體。初級轉化體由組織培養室轉移到溫室生長并收獲T1種子。5個事件得以保留，其中T1后代發生轉基因存在/缺乏的3∶1分離。通過監測可視標記的表達，在每一事件中選出大約10個含轉基因(雜合子和純合子)的T1幼苗，和大約10個缺少轉基因(無效合子)的T1幼苗。
統計分析F-檢驗使用雙因子ANOVA(變異分析)作為植物表型特性整體評估的統計模型。在由本發明基因轉化的所有事件的所有植物中，對所有測量參數進行F檢驗。進行F檢驗來檢查所有轉化事件中基因的有效性，并且驗證基因的整體效果，亦稱為整體基因效應。真實的整體基因效應顯著性的閾值設定為F檢驗的5％概率水平。顯著性F檢驗值指向基因效應，其意味著不僅僅是基因的存在或位置引起表型的差異。
3.1種子相關參數的測量成熟的原代圓錐花序被收獲、包裝、標記條形碼，然后在37℃烘箱中干燥三天。然后敲打圓錐花序并對所有種子收集和計數。用吹風裝置將飽滿的殼與空殼分離。丟棄空殼，并再次計數剩余的部分。飽滿的殼在分析天平上稱重。在分離步驟之后剩余的飽滿殼數確定為飽滿種子數。通過稱量從植物收獲的全部飽滿的殼測量總的種子產率。本發明中的收獲指數定義為總種子產率與地上面積(mm2)的比值乘以因子106。
3.2地上面積通過計算排除背景后地上植物部分的像素總數確定植物地上面積。此值是在同一時間點從不同角度獲得圖片的平均值，并通過校準將其轉換為用平方毫米表示的物理表面值。實驗顯示這種方法測量的地上部分植物面積與植物地上部分的生物量相關聯。
以下結果表顯示了T1評估和產生額外T1事件的F檢驗的p值。還顯示了轉基因和相應無效合子之間的百分數差異。例如，對于總種子重量，6個品系中的3個品系為總種子重量陽性(即與相應無效合子植物的種子重量相比，總種子重量增加(大于32％))。這樣的6個品系中的1個品系顯示總種子重量顯著增加，F檢驗的p值為0.18。
表5T1代的結果
表6T1額外事件
序 列 表<110>克羅普迪塞恩股份有限公司<120>具有改良生長特性的植物及其制備方法<130>CD-118-prio<150>EP04103303.6<151>2004-07-12<150>US60/588,917<151>2004-07-16<160>27<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>591<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1acaatttcct ccttctcccg ttataaacta aagactcgat tttgtgttga ttgttcgatt 60cacgtaatta aggagatttt tggatcaaaa gatgggtagg gtttttatgg ttgatctgga120agggaacatc tacatctgca aactctgtaa gacccatctt tctacagacc aagacatcat180gtccaagtct tttcaatgca agaacggaag agcttatctt ttcaacaacg ttgtaaacgt240atctgttgga gagaaagaag acagaatgat gataactgga ctacacaacg tagttgacat300tttctgtgtt ggttgtggat caaacgttgg ctggaaatac gagtttgcac atgaaaagag360ccagaagtat aaggaaggaa aatctgttct tgaattatac aagatttcgg gtcctcatga420tagcaacgac ttggttagtg atggagatga tgcttgattg aggctttttc cttgtctagt480tatctctctc tcagatttct tttaaatttg tacattcttg ggcctagatt ttaattcgtt540tcaatatgcg tagtggaaga ccggtttaat aattaggggt tttattttca t 591<210>2<211>121<212>PRT<213>擬南芥<400>2Met Gly Arg Val Phe Met Val Asp Leu Glu Gly Asn Ile Tyr Ile Cys1 5 10 15Lys Leu Cys Lys Thr His Leu Ser Thr Asp Gln Asp Ile Met Ser Lys20 25 30Ser Phe Gln Cys Lys Asn Gly Arg Ala Tyr Leu Phe Asn Asn Val Val35 40 45
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<221>misc_feature<222>(954)..(978)<223>n為a、c、g或t<400>15aagcgtgcag ctattcggtt atttaagagt gacgttggaa ccgaacacac aatacaatgc 60agatttgtac atactgccct cgcttgacac ccaggtcgac cagacacttg agaaatttac120tttacttatt tggtcactag tgcttggcat acaactcaga tggacttata agcaacacag180gttacgcaca tatacagcgg taacatctaa tgacttccag aagcaatagg agggatatga240tnnnnnnnnc atgtcacctg gaacagcaac aatttacgcc ggcgaattat ttcaatggag300caatccccgg ctgtcggctg cctaaagagc aacgccaccc aggttattta caggggatca360
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<400>17gcacgagaac aaaccccgca cgactcgttc tcattccact ctccaacgcg caccgggcgg 60tttttcgttc ctttcttttt ttttcccctc ttccccttcc ccttctcctt ccagcggcgc120tcaggccacc gccggccaat cccatcaccc gccggatagg gatcgacccg ttcgttgatt180ggcgcgcgcc tgcgatcgat cgattggatt gcagggttag ggcggccgcc gtcgagatag240atcgatccat ccatcgatcg aattggtttt gttggtggat cggagatatt cattcgggtc300catgggtcgg ctgctgctgg tgagcctccc ggcgacgggc gccgtcatct accgctgcaa360gcactgcgac acccacctcg cctacgacac cgacatcatc gcaaggacgt tccgctgcaa420gaacggcaag gcctacctct tcaacaggat cgtgaatgtg aatgttggta cgaaggagga480ggaccggatg atgacgacgg gcctgcacac cgtgtgcgac atcttctgcg tcgcctgcgg540agccatactc ggctggaaat acctcgtcgc cttcgacaag agccagaggt acaaggaagg600caagttcatc ctcgacaggt ccaccgcctt ggcagccgct cctggtgatg ccgctgctga660ccaccaccac caccacgctc gcgtagcaag ctccgatgac gaagatgacc atatgtgaat720gatgatgatg atgaatgtca tctgcattgc attcaccata atcccttgct atctgtaaat780actctactcc gcttgttgta gtcgttcgtc gtaaagcacc tatatgtttc catttgttca840acctatcaga ctatgatatg atcagcaagt aaggtccatt tgtttggatg cagcgacagt900tacaaacaaa aaaattaaaa920<210>18<211>138<212>PRT<213>玉蜀黍<400>18Met Gly Arg Leu Leu Leu Val Ser Leu Pro Ala Thr Gly Ala Val Ile1 5 10 15Tyr Arg Cys Lys His Cys Asp Thr His Leu Ala Tyr Asp Thr Asp Ile20 25 30Ile Ala Arg Thr Phe Arg Cys Lys Asn Gly Lys Ala Tyr Leu Phe Asn35 40 45Arg Ile Val Asn Val Asn Val Gly Thr Lys Glu Glu Asp Arg Met Met50 55 60Thr Thr Gly Leu His Thr Val Cys Asp Ile Phe Cys Val Ala Cys Gly65 70 75 80Ala Ile Leu Gly Trp Lys Tyr Leu Val Ala Phe Asp Lys Ser Gln Arg85 90 95Tyr Lys Glu Gly Lys Phe Ile Leu Asp Arg Ser Thr Ala Leu Ala Ala100 105 110Ala Pro Gly Asp Ala Ala Ala Asp His His His His His Ala Arg Val115 120 125Ala Ser Ser Asp Asp Glu Asp Asp His Met130 135
<210>19<211>360<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>19atggggctgc tgttcgtgga gctgctcccg cggcacggcg acgggggagg ccccgcgtcg 60gcggtgctca agtgccgccg gtgccgcgtc gacgccgcct ccgccgacgc catcctctca120cgggacttcc gcggccgatt cggccgcgcc tacctcttcg accacgtggt gaatatatcc180ttagggccta atgaggatcg gtatctgatg accggactgc atacggtgaa agatatctac240tgtagctgtt gccagcaaat tctcggctgg agatatgaga aagcatacga agagagcgag300aagtacaagg aaggcaagtt catcctggag aaggccagga tgtggaaaga agcccggtga360<210>20<211>119<212>PRT<213>稻<400>20Met Gly Leu Leu Phe Val Glu Leu Leu Pro Arg His Gly Asp Gly Gly1 5 10 15Gly Pro Ala Ser Ala Val Leu Lys Cys Arg Arg Cys Arg Val Asp Ala20 25 30Ala Ser Ala Asp Ala Ile Leu Ser Arg Asp Phe Arg Gly Arg Phe Gly35 40 45Arg Ala Tyr Leu Phe Asp His Val Val Asn Ile Ser Leu Gly Pro Asn50 55 60Glu Asp Arg Tyr Leu Met Thr Gly Leu His Thr Val Lys Asp Ile Tyr65 70 75 80Cys Ser Cys Cys Gln Gln Ile Leu Gly Trp Arg Tyr Glu Lys Ala Tyr85 90 95Glu Glu Ser Glu Lys Tyr Lys Glu Gly Lys Phe Ile Leu Glu Lys Ala100 105 110Arg Met Trp Lys Glu Ala Arg115<210>21<211>836<212>DNA<213>稻
<400>21gatttttctt ctcccaaact ccggcgactc ctccgctaat cccctccggc gccgcctcct 60ctccgctccc cgcgcccccc acctccggtc acgcccgatc ggattggttg agttgcctcg120agggattttt gctctcgagg tatggtgttc atggcggagc tggtgggtcc gcgggtgtac180agctgctgca actgccggaa ccacgtctgc ctccacgacg acatcatctc caaggctttt240caggggagga atggccgtgc ctttctgttc tctcatgcca tgaatgttgt tgtgggcgcg300aaggaggaca ggcaacttat gacggggctt cacactgttg ctgatatcta ttgcaatgat360tgccgggagg tgttgggctg gaagtacgag agagcctatg aggaaacaca gaagtacaag420gaagggaagt tcatatttga gaagtcaaaa atcgtcaaag agaactggta gaatccaaaa480gattaggcac tccaaacttt ctttagagga tgaaacattc actgttccaa ggttatcagt540gtgttctggt tctttatgtc tttgtaaata tcagtcatcc acaagtttta atcttaagtc600tgcctgttct tgccttgccg tgaagtgtaa attgttcttg ctcccgtttc tttctgtgaa660taacatatgg cctgtgggta tttgttcttg aaccatgtgt gctaatgtgc gtaattttat720aggtactaaa agaatgtttg tatctttctc ctgcacaaga ataccgcgtg gagatttaca780gtcaaatata atctgacatg atttaatcaa aatttgttgg gaagttgtga agtaag836<210>22<211>109<212>PRT<213>稻<400>22Met Val Phe Met Ala Glu Leu Val Gly Pro Arg Val Tyr Ser Cys Cys1 5 10 15Asn Cys Arg Asn His Val Cys Leu His Asp Asp Ile Ile Ser Lys Ala20 25 30Phe Gln Gly Arg Asn Gly Arg Ala Phe Leu Phe Ser His Ala Met Asn35 40 45Val Val Val Gly Ala Lys Glu Asp Arg Gln Leu Met Thr Gly Leu His50 55 60Thr Val Ala Asp Ile Tyr Cys Asn Asp Cys Arg Glu Val Leu Gly Trp65 70 75 80Lys Tyr Glu Arg Ala Tyr Glu Glu Thr Gln Lys Tyr Lys Glu Gly Lys85 90 95Phe Ile Phe Glu Lys Ser Lys Ile Val Lys Glu Asn Trp100 105<210>23<211>913<212>DNA<213>稻<400>23gctgcttttg cttcggtcac ccggtcagtg ctgcagacaa gccaccccct tcctcgcgta 60
gactgctccc cccacaaaca aaagcaatcc taatctcgga ttcgaggcga acgagcggcg120gcgagggagg gggactagcg gcgatcgcga ttggagtcgg gtggacaccg atcgcggcgg180cgctctgggg gatcggggtg tggaatcgag ggggagggag gaggagacgg aggcgatggg240gcggctgttc gtgatgcacc tggaagggaa ggtgtacagc tgcaagcact gccacacgca300cctcggcctc tcctccgaca tcatctccaa gtccttccat tgcaagcacg ggaaggcgta360cctcttcaat aaggttgtca atgtgacttc tggagtaaaa gaggatcgca tgatgataac420cggaatgcat actgtgtctg atatcttctg tgttggctgc ggatccattg ttggatggaa480atatgaagct gcacatgaga agagccagag gtacaaggaa gggaaattta ttttagagag540gtataaggtg tctggtcctg atggcagcca ctactttgtt acacatgatg ctcatgttgg600gggaagcgac gtggacgacg tatgaagcac aactcgacat gctcaagcct tatccatgta660atccatgtaa ataacccaag tgtttgttgg tcttagttac ccggggattt gcttccattc720agagcaaccc cagcgtaatt gttgtcctag atgacctaat atcctatcat cttccttcag780gagttcaggt tattattggg tgttaccgtc tgtatatgca tgtaaccagt gatgcctgta840gtagccccct aaaagctgtt gtaatcctgg aatgtatctc aggccctaat gactaaataa900aattctgctt ctc 913<210>24<211>129<212>PRT<213>稻<400>24Met Gly Arg Leu Phe Val Met His Leu Glu Gly Lys Val Tyr Ser Cys1 5 10 15Lys His Cys His Thr His Leu Gly Leu Ser Ser Asp Ile Ile Ser Lys20 25 30Ser Phe His Cys Lys His Gly Lys Ala Tyr Leu Phe Asn Lys Val Val35 40 45Asn Val Thr Ser Gly Val Lys Glu Asp Arg Met Met Ile Thr Gly Met50 55 60His Thr Val Ser Asp Ile Phe Cys Val Gly Cys Gly Ser Ile Val Gly65 70 75 80Trp Lys Tyr Glu Ala Ala His Glu Lys Ser Gln Arg Tyr Lys Glu Gly85 90 95Lys Phe Ile Leu Glu Arg Tyr Lys Val Ser Gly Pro Asp Gly Ser His100 105 110Tyr Phe Val Thr His Asp Ala His Val Gly Gly Ser Asp Val Asp Asp115 120 125Val<210>25
<211>2193<212>DNA<213>稻<400>25aatccgaaaa gtttctgcac cgttttcacc ccctaactaa caatataggg aacgtgtgct 60aaatataaaa tgagacctta tatatgtagc gctgataact agaactatgc aagaaaaact120catccaccta ctttagtggc aatcgggcta aataaaaaag agtcgctaca ctagtttcgt180tttccttagt aattaagtgg gaaaatgaaa tcattattgc ttagaatata cgttcacatc240tctgtcatga agttaaatta ttcgaggtag ccataattgt catcaaactc ttcttgaata300aaaaaatctt tctagctgaa ctcaatgggt aaagagagag atttttttta aaaaaataga360atgaagatat tctgaacgta ttggcaaaga tttaaacata taattatata attttatagt420ttgtgcattc gtcatatcgc acatcattaa ggacatgtct tactccatcc caatttttat480ttagtaatta aagacaattg acttattttt attatttatc ttttttcgat tagatgcaag540gtacttacgc acacactttg tgctcatgtg catgtgtgag tgcacctcct caatacacgt600tcaactagca acacatctct aatatcactc gcctatttaa tacatttagg tagcaatatc660tgaattcaag cactccacca tcaccagacc acttttaata atatctaaaa tacaaaaaat720aattttacag aatagcatga aaagtatgaa acgaactatt taggtttttc acatacaaaa780aaaaaaagaa ttttgctcgt gcgcgagcgc caatctccca tattgggcac acaggcaaca840acagagtggc tgcccacaga acaacccaca aaaaacgatg atctaacgga ggacagcaag900tccgcaacaa ccttttaaca gcaggctttg cggccaggag agaggaggag aggcaaagaa960aaccaagcat cctcctcctc ccatctataa attcctcccc ccttttcccc tctctatata 1020ggaggcatcc aagccaagaa gagggagagc accaaggaca cgcgactagc agaagccgag 1080cgaccgcctt cttcgatcca tatcttccgg tcgagttctt ggtcgatctc ttccctcctc 1140cacctcctcc tcacagggta tgtgcccttc ggttgttctt ggatttattg ttctaggttg 1200tgtagtacgg gcgttgatgt taggaaaggg gatctgtatc tgtgatgatt cctgttcttg 1260gatttgggat agaggggttc ttgatgttgc atgttatcgg ttcggtttga ttagtagtat 1320ggttttcaat cgtctggaga gctctatgga aatgaaatgg tttagggtac ggaatcttgc 1380gattttgtga gtaccttttg tttgaggtaa aatcagagca ccggtgattt tgcttggtgt 1440aataaaagta cggttgtttg gtcctcgatt ctggtagtga tgcttctcga tttgacgaag 1500ctatcctttg tttattccct attgaacaaa aataatccaa ctttgaagac ggtcccgttg 1560atgagattga atgattgatt cttaagcctg tccaaaattt cgcagctggc ttgtttagat 1620acagtagtcc ccatcacgaa attcatggaa acagttataa tcctcaggaa caggggattc 1680cctgttcttc cgatttgctt tagtcccaga attttttttc ccaaatatct taaaaagtca 1740ctttctggtt cagttcaatg aattgattgc tacaaataat gcttttatag cgttatccta 1800gctgtagttc agttaatagg taatacccct atagtttagt caggagaaga acttatccga 1860tttctgatct ccatttttaa ttatatgaaa tgaactgtag cataagcagt attcatttgg 1920attatttttt ttattagctc tcaccccttc attattctga gctgaaagtc tggcatgaac 1980tgtcctcaat tttgttttca aattcacatc gattatctat gcattatcct cttgtatcta 2040cctgtagaag tttctttttg gttattcctt gactgcttga ttacagaaag aaatttatga 2100agctgtaatc gggatagtta tactgcttgt tcttatgatt catttccttt gtgcagttct 2160tggtgtagct tgccactttc accagcaaag ttc2193<210>26<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物prm03198
<400>26ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgggt agggttttta tggttgatc 59<210>27<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物prm03199<400>27ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta atcaagcatc atctccatca ctaac 5權利要求
1.改良植物生長特性的方法，包括步驟(A)增加植物中YIPPEE樣多肽或其同源物的活性，所述YIPPEE樣多肽或其同源物包括下列任一或多個基序，優選包含所有基序(i)推定的鋅結合基序2×CXXC，其中X是任意的氨基酸殘基；(ii)KYKEGK基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；(iii)GRAYLF基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；和(B)任選地選擇具有改良的生長特性的植物。
2.根據權利要求1的方法，其中通過優選地在編碼YIPPEE樣多肽或其同源物的基因座導入遺傳修飾來實現所述增加的活性是。
3.根據權利要求2的方法，其中通過定向誘變、定向進化、同源重組、TILLING、T-DNA激活中的任一或多個以及通過在植物中導入和表達編碼YIPPEE樣多肽的核酸實現所述遺傳修飾。
4.改良植物生長特性的方法，包括在植物中導入和表達YIPPEE樣核酸或其變體，所述YIPPEE樣核酸或其變體編碼包括下列任一或多個基序優選包括所有基序的YIPPEE樣多肽或其同源物(i)推定的鋅結合基序2×CXXC，其中X是任意氨基酸殘基；(ii)KYKEGK基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；(iii)GRAYLF基序，其允許在任意位置的一個氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代。
5.根據權利要求4的方法，其中所述變體是YIPPEE樣核酸的部分或者能與YIPPEE樣核酸雜交的序列。
6.根據權利要求4或5的方法，其中所述YIPPEE樣核酸或其變體在植物中過表達。
7.根據權利要求4到6中任一項的方法，其中所述YIPPEE樣核酸或其變體是植物來源的，優選來自雙子葉植物，進一步優選來自十字花科(Brassicaceae)，更加優選核酸來自擬南芥。
8.根據權利要求4到7中任一項的方法，其中所述YIPPEE樣核酸或其變體有效地連接于組成型啟動子。
9.根據權利要求8的方法，其中所述構成型啟動子是GOS2啟動子。
10.根據權利要求1到9中任一項的方法，其中所述改良的植物生長特性是相對于相應的野生型植物而言增加的產率。
11.根據權利要求1到10中任一項的方法，其中所述改良的植物生長特性是增加的植物生物量。
12.根據權利要求10的方法，其中所述增加的產量是增加的種子產量。
13.根據權利要求12的方法，其中所述增加的種子產率選自以下的任一個或多個(i)增加的種子生物量；(ii)增加的(飽滿)種子數；(iii)增加的種子大小；(iv)增加的種子體積；(v)增加的收獲指數；和(vi)增加的千粒重(TKW)。
14.根據權利要求1到13中任一項的方法，其中所述改良的植物生長特性是增加的生長速率。
15.可根據權利要求1到14中任一項的方法獲得的植物。
16.構建體，包括(i)YIPPEE樣核酸或其變體；(ii)能夠驅動(i)的核酸序列表達的一個或多個控制序列；和任選的(iii)轉錄終止序列。
17.根據權利要求16的構建體，其中所述啟動子是組成型啟動子。
18.根據權利要求17的構建體，其中所述啟動子是GOS2啟動子。
19.使用根據權利要求16到18中任一項的構建體轉化的植物。
20.產生具有改良生長特性的轉基因植物的方法，該方法包括(i)向植物中導入YIPPEE樣核酸或其變體和/或在YIPPEE樣基因座導入遺傳修飾；(ii)在促進植物生長和發育的條件下培養植物細胞。
21.具有改良生長特性的轉基因植物，其通過將YIPPEE樣核酸或其變體導入所述植物產生和/或通過在YIPPEE樣基因座導入遺傳修飾產生。
22.根據權利要求15、19或21的轉基因植物，其中所述植物是單子葉植物，如甘蔗，或者其中所述植物是谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥或高粱。
23.根據權利要求15、19、21或22中任一項的植物的可收獲部分。
24.根據權利要求23的可收獲部分，其中所述可收獲部分是種子。
25.從根據權利要求15、19、21或22中任一項的植物直接衍生的產品，和/或從根據權利要求23或24的可收獲部分直接衍生的產品。
26.YIPPEE樣核酸/基因或其變體或YIPPEE樣多肽或其同源物在改良植物生長特性，特別是改良產率/生物量，尤其是種子產率中的用途。
27.根據權利要求25的用途，其中所述種子產率包括以下的一個或多個增加的(飽滿)種子數、增加的種子重量、增加的收獲指數和增加的TKW。
28.YIPPEE樣核酸/基因或其變體或YIPPEE樣多肽或其同源物作為分子標記的用途。
全文摘要
本發明涉及通過增加植物中YIPPEE樣多肽或其同源物的活性來改良植物生長特性的方法。這樣的方法包括向植物中導入YIPPEE樣核酸或其變體。本發明還涉及含有導入了本文的YIPPEE樣核酸或其變體的轉基因植物，所述植物與相應的野生型植物相比，具有改良的生長特性。本發明也涉及在本發明方法中有用的構建體。
文檔編號C12N15/82GK101014614SQ200580029273
公開日2007年8月8日 申請日期2005年7月12日 優先權日2004年7月12日
發明者C·魯茲 申請人:克羅普迪塞恩股份有限公司