專利名稱：抑制農作物中黃單胞菌感染的生物免疫－攻擊素組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種復合型攻擊素，它來源于生物提取混合物，用于在農作物中控制和預防致植物病的黃單胞菌(Xanthomonad)感染。本發明是以使用來自非致植物病的黃單胞菌屬種(Xanthomonasspp)、哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)和來自植物絲蘭萃(Yuccaschidigera)的生物提取物的組合混合物針對致植物病的黃單胞菌引起抗性的原理為基礎。本方法是環保的，并且提供了針對許多黃單胞菌屬種及其致病變種的植物保護。
背景技術：
黃單胞菌屬(Xanthomonas Dowson 1939)包括多組革蘭氏陰性、專性需氧、非發酵的桿菌，它們可通過單極生鞭毛運動，并能合成溴化黃色色素，該色素被稱為黃單胞菌黃素。所有已報道的該菌屬的菌株均被報道與植物相關，并且大部分對特定的植物宿主具有致病性。根據微生物學分類，該菌屬可被分為至少五個單獨的菌種野油菜黃單胞菌(X.compestris)，草莓黃單胞菌(X.fragariae)，葡萄酒黃單胞菌(X.ampelina)，白紋黃單胞菌(X.albilineans)和地毯草黃單胞菌(X.axonopodis)(Young，K.M.，Due D.w.，Bradbury J.F.et al.1978.Aproposed nomenclature and classification for plant pathogenic bacteria.N.Z.J Agric Res.21153-177；Vauterin，L.，Yang，P.，Hoste，B.et al.1992.Taxonomy of xanthomonads from cereals and grasses，based onSDS-PAGE of proteins，fatty acid analysis and DNA hybridization.J.Gen.Microbiol.1381467-1477)。
在自然界中，這些細菌基本上是獨立生存的，構成根際和葉際微生物區系的一個大群(Vauterin，L.，Yang，P.，Alverez A.et al.1996.Identification of non-pathogenic Xanthomonas strains associated withplants.Syst.Appl.Microbiol.1996-105)。已知許多黃單胞菌屬種是致植物病的，可引起破壞性的農作物疾病，如在多種柑桔屬種(Citrusspp)中出現的柑桔潰瘍，柑桔的細菌性葉斑病以及甘蔗中的葉鱗病(leaf scaled disease)(Bradbury，J.F.1986.Xanthomonas Dowson 1939，187.Pages 198-260.Bacteria.CAB International Mycological Institute，Slough，England)。
盡管就與黃單胞菌的致病菌種相關的遺傳致病因子而論已有許多出版物，但是涉及對集群的入侵和生物膜相互作用的基本模式的文獻非常少。黃單胞菌屬種的致病菌株的最可能的入侵位點是通過氣孔或者通過傷口進入到植物的葉或果實中(Zubrzycki，H.M.andDiamante，D.Z.A.1987.Relationship between the amount of theinoculum and the infection in the fields.Pages 379-382 inProc.Int.Soc.Citriculture，Sao Paulo，Brazil；Schubert T.S.，Rizvl，S.A.Sun.X etal.2001.Meeting the challenge of eradicating citrus canker inFlorida-Again.Plant Disease 85340-356)。但是，通過氣孔的天然入侵可能要求較高的接種源。該濃度較在健康葉際條件下正常能獲得的濃度高(Pruvost，o.，Boher，B.，Brocherieux M.，et al.2001.Survival ofXanthomonas axonopodis pv.Citri in leaf lesions under tropicalenvironmental conditions and simulated splash dispersal of inoculum.Phytopathology 92336-346)。因此，該微生物入侵的基本模式可能主要通過植物的損傷區(不為理論確認)。該損傷可通過機械手段或者通過昆蟲引起的損傷出現。
控制黃單胞菌屬種感染植物的現有方法包括使用含有銅的噴霧劑。同樣該噴霧劑也可用來在表面改變某些柑橘果實上的潰瘍損傷。但是，由于噴霧劑具有毒性，因此使用該噴霧劑受到一定的限制。另外，一些黃單胞菌屬種對于這種含銅試劑已產生了抗性(Gardan，L.，Brault，T.，and Germain E.1993.Copper resistance of Xanthomonascampestris pv.Juglands in French walnut orchards and it associationwith conjugative plasmids.Acta Hort.(ISHS)311239-265)。因此，先驗的結果表明許多黃單胞菌屬種對含銅噴霧劑具有抗性。這可能不僅包括地毯草黃單胞菌柑桔致病變種—柑桔潰瘍的病原。另外，已表明使用這種噴霧方法可加重柑桔細菌性斑點病的傳播(Gottwald，T.R.，Graham，J.H.，and Riley T.D.1997.The influence of spray adjuvantson exacerbation of citrus spot.Plant Disease.811305-1210)。
在控制與黃單胞菌相關的疾病方面，大部分國家都采用了頗多根除方案。最流行的是Florida的針對柑桔潰瘍的根除方案。一方面嚴格執行使用多種試劑的控制性凈化作用，Florida法也包括除去及破壞在感染區的特定半徑內被感染的樹木。對于該方法的一個擔憂是除去這些被感染的樹木的方法可能有助于細菌的擴散。但是，控制措施不是很成功，并且對于控制機構和柑橘園主而言都非常昂貴。因此，需要尋求方便經濟地控制該疾病的其它方法。
在自然界中，許多根際和葉際微生物區系具有這樣的特征它們通過競爭營養物質或者釋放損傷或殺傷可能的病原體的因子使得一些致病細菌菌種保持平衡。該特征集中在生物控制的概念上。自從20世紀90年代初期，大量努力均集中在使用可分泌針對該病原體的殺傷因子的有機體或針對該病原體更嚴格地競爭營養物從而競爭性阻止更多病原體菌種的生長的有機體來控制真菌性和細菌性疾病。
盡管生物控制的概念在控制許多真菌性疾病上非常有效，但是最近生物控制才開始集中在黃單胞菌相關的感染上。例如，已在接近宿主植物的土壤中控制某些致病性黃單胞菌屬種的根際中鑒定了某些以原生動物為食的細菌(Habte，M and Alexander，M.1975.Protozoa asagents responsible for the decline of Xanthomonas campestris in soil.Appl.Microbiol.29(2)159-164)。到目前為止，這種有機體還沒有用來對抗黃單胞菌相關的疾病。相反，黃單胞菌已作為生物控制劑用于控制害草。野油菜黃單胞菌早熟禾致病變種(Xanthomonas campestris pv.poae)被用作一年生莓系屬的牧草的生物控制劑(Imaizumi，S.，Tateno，A.，Morita，K.，Fujimori.1999.Sensonal factors affecting the control ofannual bluegrass(Poa annua)with Xanthomonas campestris pv.poaeBiol.Control 1618-26)。
某些情況下，致植物病的微生物自身的入侵會在植物中誘導防御機制，以預防進一步損傷。在一些農作物中大多數損傷并不會被感染，這是由于植物自身的防御系統。現有的許多出版物證實一些根際微生物可在植物中誘導針對根部和葉部疾病的系統抗性。例如，促進植物生長的根瘤菌熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)和粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)可在黃瓜中誘導針對炭疽病(Wei，G.，Kloepper，J.W.，and Tuzun，S.1991.Induction of systemic resistance ofcucumber to Colletotrichum orbiculare by select strains of plant growthpromoting rhizobacteria.Phytopathology 811508-1512)和黃瓜花葉病毒(Raupach，Gs.，Liu，L.Murphy K.F.et al.1996．Induced systemicresistance in cucumber and tomato against cucumber mosaiccucumovirus using plant growth-promoting rhizobacteria.PlantDisease.80891-894)的系統抗性。
利用植物防御機制的誘導，來自多種非植物致病性微生物(主要參與堆制肥料的真菌和細菌)的提取物已用于對抗多種致植物病的微生物，前提是先誘導抗性，然后暴露于非植物致病性微生物的提取物中。該制劑在美國專利No.6,326,016中得以描述。
事實上，與合成堆肥茶相關的微生物的代謝物在控制某些最具有破壞性的與黃單胞菌屬種相關的疾病(如柑桔潰瘍)上非常有效。這在健康柑桔樹上作為防范措施更為成功(Ozores-Hampton，M.O.andObreza，T.A..2000.A composted waste use on Florida cropsA Review.International Composting Symposium，Nova Scotia)。另外，已有的證據表明成團泛菌(Pantoea agglomerans)菌株E278Ar可誘導針對野油菜黃單胞菌假辣根致病變種(X.campestris pv.armoraciae)的系統抗性，該變種可在蘿卜中誘導葉斑病(Han，D.，Y.，Colin，D.L.，Bauer，W.D.，and Hoitink，H.A.J.2000.A rapid bioassay for screeningrhizosphere microorganisms for their ability to induce systemicresistence.Phytopathology 90327-332)。
早在1991年，許多研究就集中在這類微生物引起針對特定致植物病原體的植物抗性的作用上。將非致病性微生物暴露給植物所誘導的這種類型的系統抗性被稱為誘導性系統抗性(ISR)(Kloepper，J.W.，Tuzun，S.，and
J.A.1992.Proposed definitions related to induceddisease resistance.Biocontrol Sci.Techno1.2349-351)。它不同于由引起壞死的植物病原體所誘導的系統獲得性抗性(SAR)(Delaney，T.P.1997.Genetic dissection of acquired resistance to disease.Plant Physiol.1135-12；Ryals，J.，Neuenschwander，U.H.，Willits，M.G.et.al.1994.Systemic acquired resistance.Plant cell 81809-1819)。
基于對ISR和SAR理解的快速發展，已經開發了幾種引發植物防御反應的合成型化合物。已開發了其中的一種化合物苯并噻二唑(acibenzolar-S-methyl，Actigard 50W，Bion 50WG，Syngenta，BaselSwitzerland)。這些化合物在控制西紅柿中地毯草黃單胞菌茄科致病變種(X.axonopodis pv.vesicatoria)所誘發的細菌性斑點病上不是很成功(Louws，F.J.，Wilson，M.，Campbell，H.L.，et al.2001.Field controlof bacterial spot and bacterial speck of tomato using a plant activator.Plant Disease.85481-488)。不存在其它激活劑。但是，在使用合成型激活劑方面的主要擔憂是在控制田間應用期間疾病抗性的誘導上長期的植物毒性和生物活性。
存在天然的植物抗性激活劑。這類激活劑中的其中一種是核黃素。已證實核黃素可作為有效的系統抗性引發劑起作用，并可作為植物中的激活劑通過誘導發病相關基因的表達的信號傳導通路起作用(Dong，H.and Beer，S.V.2000.Riboflavin induces disease resistancein plants by activating a novel signal transduction pathway.Phytopathology 90801-811)。將核黃素作為系統抗性引發劑的直接應用局限于實驗室實驗。目前核黃素在田間多種植物上的使用還沒有正式實施。
同樣，已就硅(Si2)在引發針對疾病的植物抗性的作用上對其進行了研究。這種作用是有爭議的(Werner D.，and Roth R.1983.Silicametabolism.Pages 683-694 inInorganic Plant Nutrition.A.Luchiand R.L.Bieleski，eds.Sringer-verlag，Berlin；and Epstein，E.1994.The anomaly of silicon in plant biology.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9111-17)。但是，這種爭議考慮到對植物的被動機械性保護。然而，Si2在使某些雙子葉植物免于感染真菌性疾病上是有效的，并且針對這種入侵病原體表現出SAR的某些方面(Bélanger，R.R.，Bowen，P.A.，Ehret，D.L.et al.1995.Soluble siliconIts role in crop and diseasemanagement of green house crops.Plant Disease.79329-336)。
另外，Fawe等人已提供了提示Si2可通過誘導黃瓜合成諸如黃酮醇去糖基型鼠李黃素(flavonol aglycone rhamnetin)的植物抗毒素使黃瓜免受終極腐霉菌(Pythium ultimum)感染的證據(Fawe，A.，Abouu-zaid，M.，Menzies，J.G.et al.1998.Silicon-mediatedaccumulation of flavonoid phytoalexins in cucumber.Phytopathology88396-401)。
盡管該試劑在用于使植物免受疾病感染方面存在爭議，本領域的普通技術人員還是能夠確定可將該試劑納入本發明中。但是，已知用于本發明的產品中的來源于絲蘭萃的提取物具有多種植物生長促進劑和植物保護刺激劑(Zielgler，D.M.1990.Flavin-containingmonooxygenasesenzymes adapted for multisubstrate specificity.Trends in Pharmacol.Sci.11321-324；Ziegler，D.M.1993.Recentstudies on the structure and function of multisubstrateflavin-containing monooxygenases.Ann.Rev.Pharmacol.Toxicology33179-199；Zhoa，Y.，Christensen，S.K.，Frankhauser，C.，et al.2001.Arole for flavin monooxygenase-like enzymes in auxin biosynthesis.Science 291306-309)。
在生物控制方面，許多木霉菌屬種作為針對植物真菌性疾病的生物控制劑使用，并表現出引發針對該病原體的SAR的能力。已鑒定出來源于真菌有益木霉菌(Trichoderma virens)的這類引發劑中的一種，并在美國專利No.6,242,420中描述。但是，它的田間應用目前尚未解決，并且它基本上針對于根際相關的真菌性植物疾病。
木霉菌屬的許多真菌合成殺傷或抑制多種需氧菌和厭氧菌的生長的物質。基于該原則，有益木霉菌(T.virens)作為植物病原體的真菌寄生物和合成抗生素的拮抗劑使用，并且被證實是針對多種土壤引發的根部疾病的有效的生物控制劑(Reyes A.A.1985.Suppression ofFusarium and Pythium pea root rot by antagonistic microorganisms，Phvtoprotect.6623-29)。另外，有益木霉菌的原始培養物和培養過有益木霉菌的培養基已作為針對多種致植物病的真菌的生物控制劑來使用，參見Tahvonen等人的美國專利No.5,968,504。使用該有機體的一個主要問題該制劑的穩定性；因此，該有機體的生命力受到了影響。該制劑在美國專利No.4,724,147中描述。同樣，來自木霉菌屬種的提取物與其它添加的微生物提取物一起使用，以在植物中誘導針對致植物病的微生物的抗性，參見美國專利No.6,326,016。
木霉菌屬種合成大量被認為是抗生素的物質，包括膠霉毒素、綠膠霉素、氯粘帚霉素(gliovirin)和萜烯七酯酸。萜烯七酯酸是有效的抗生素和抗真菌劑(Ghisalberti，E.L.and Sivasithamparan，K.1991.Antifungal antibiotics produced by Trichoderma spp.Soil Biol.Biochem.231011-1021)。
許多木霉菌屬種合成多種具有較強抗生素活性的產物。這類代謝物中的一種被稱為哌珀霉素(peptaibols)。它們是范圍在15到20個氨基酸的短鏈多肽。它們的大部分氨基酸是非典型的，如羥脯氨酸、異纈氨酸、乙基正纈氨酸和氨基異丁氨酸。正如名字所提示的那樣，哌珀霉素一般被認為是蛋白抗生素。哌珀霉素的抗微生物活性被認為是由于它可破壞脂質膜的完整性的能力所引起的，因此，針對革蘭氏陰性菌和真菌更有效。到目前為止，特征最為清楚的哌珀霉素在真菌的木霉菌屬和翅孢殼菌屬(Emericellopsis)中所公開。
在本發明中，來自哈茨木霉菌的哌珀霉素包括哈木菌素(trichorzianin)、trichokindin、trichorzine和harzianin(EI Hajji，M.，Rebuffat，S.，Lecommandeur，D.，and Dodo，B.1987.Isolation andsequence determination of trichorzianines A antifungal peptides fromTrichoderma harzianum.Int J Peptide Protein Res.29207-215；Lida A，Sanekata，M.，Fugita，T.et al.1987.Fungal metabolites XVI.Structureof new peptaibols，trichorzins I-VI from the fungus TrichodermaHarzianum.Int J Peptide Protein Res.29207-215；Rebuffat，S.，EIHajji，M.，Henning，P.et al.1989.Isolation sequence，and conformationof seven trichorzianines B from Trichoderma harzianum.Int J PeptideProtein Res.34200-210；Sawa，R.，Mori，Y.，Inuma，H.1994.Harzianicacid，a new microbial antibiotic from a fungus.J.Antibiotics(Tokyo)47731-732)。本發明利用了哈茨木霉菌的該代謝物的產生。
哈茨木霉菌菌株在某些植物中被用作針對線蟲和真菌性疾病的生物控制劑，并被指認為植物促進劑(引自美國專利No.6,475,772)。同樣，哈茨木霉菌的某些菌株無需要求臨時容許量(temporarytolerance)，并在農作物中作為與根際相關的真菌性疾病的生物控制劑使用(Hasan，S.B.2000.Trichoderma harzianum Rifai Strain T-39；Exemption from the requirements of a Tolerance，Federal Register65121，pp.38753-38757)。然而，關于它針對葉際病原體-特別是針對屬于黃單胞菌屬的病原體的文獻報道很少。
將木霉菌屬種作為針對真菌植物病原體的生物控制劑更為成功。引起該作用的主要機理包括入侵的病原體和植物宿主的微寄生關系，它引起一連串事件，包括引起植物宿主細胞的防護性相互作用以及被所使用的木霉菌屬種對目標真菌病原體的直接降解。
由木霉菌屬種所分泌的分泌型殼多糖酶(chintanase)和葡聚糖酶(glucanase)(β-1，3-葡聚糖酶和β-1，6-葡聚糖酶)不僅會引起降解其它微寄生物，而且還在引發植物細胞防御機制中起作用。盡管據報道該葡聚糖酶可溶解真菌和酵母壁，但是該酶還被報道可溶解細菌(Dela Cruz，J，Pintor-Toro，J.A.，Benítez，T.，and Llobell，A.1995.Purfication and characterization of an endo-β-1，6-glucanase ininducing host cell defense response remain obscure)。盡管如此，殼多糖酶(chintanase)、β-1，3-葡聚糖酶和β-1，6-葡聚糖酶在誘導宿主細胞防御反應中的作用仍然不清楚。
使用許多木霉菌屬種的一個主要問題是它們合成可損傷目標宿主植物的毒植物素。這類毒素中的其中一種是綠膠霉素(Jones，R.W.，W.T.Lanini，and J.G.Hancock.1988.Plant growth response to thephytotoxin viridiol produced by the fungus Gliocladium virens.WeedSci.36683-687；Weindling，R.，and O.H.Emerson.1936.The isolationfo a toxin substance from the culture filtrate of Trichoderma.Phytopathology 261068；Howell，C.R.，and R.D.Stipanovic.1984.Phytotoxicity to crop plants and herbicidal effects on weeds of viridiolproduced by Gliocladium virens.Phytopathology 741346-1349)。在這方面，哈茨木霉菌也合成綠膠霉素。
在這類真菌中，綠膠霉素與固醇合成有關，在1994年，Howell和Stipanovic發現當在添加的類固醇抑制劑存在時培養真菌，綠色粘帚霉(Gliocladium virens)的綠膠霉素產量顯著減少。同樣，據報道這類真菌不僅綠膠霉素(作為綠毛菌醇)產量減少，而且該菌種的植物毒性也降低(Howeel，C.R.，and Stipanovic R.D.1994.Effect of sterolbiosynthesis inhibitors on phytotoxin(viridin)production byGliocladium virens in culture.Phytopathology 84969-972)。誘導抑制綠毛菌醇的方法在美國專利No.5,882,915中得以較為詳細的描述。根據本發明，本領域的微生物學家可快速發現這些方法可運用于本發明。但是，由于本發明所采用的提取方法，哈茨木霉菌的回收產物還含有非常少量的綠膠霉素和綠毛菌醇—如果存在的話。
根據本發明，我們最初使用來自佛羅里達州的拉哥(Largo，FL)的Venture Biodiscovery的哈茨木霉菌的一個菌株的提取物。該菌株MBMH-21首次從德克薩斯州的米申(Mission，Texas)的土壤樣品中分離獲得。但是，根據本發明，我們發現多種哈茨木霉菌效果良好。所使用的這些菌株包括哈茨木霉菌(美國典型培養物保藏中心(ATCC)No.20873)。其它容易從銷售商以及哈茨木霉菌的新鮮土壤分離物獲得的菌株也被用于本發明。
使用哈茨木霉菌生物提取物和/或完整的活的哈茨木霉菌(或者其它木霉菌屬種)是基于上文所述的誘導性系統抗性現象。如上所述，當非致病性有機體被導入宿主中時(這激發一連串對抗致病性有機體入侵的防御反應)，就可觀察到這種現象。植物暴露到相關的非致病性菌種可針對相關植物病原體引發ISR是理所當然的。根據本發明，我們使用非致病性黃單胞菌屬種的提取物。下文本發明詳細描述中將介紹這種應用。根據本發明，我們使用X.theicola和X.codiaei的提取物。這些有機體可從土壤和某些植物中分離得到。另外，它們可從諸如ATCC的保藏機構購買。
本發明的另外一個組分是植物絲蘭萃的提取物。這類提取物包括皂苷。皂苷是許多植物合成的天然去污劑。皂苷具有去污劑或表面活性劑性質是因為它們含有水溶性組分和脂溶性組分。它們由脂溶性中心部分組成，該中心部分具有膽固醇結構或三萜系化合物結構，并且具有一條或多條水溶性碳水化合物的側鏈。皂苷被用于多種食品、飼料、化妝品和飲料中。同樣，它們還被指出在治療多種疾病中具有治療價值(Bingham，R.，Bellew，B.A.，Bellew J.G.1975.Yucca plantsaponin in the management of arthritis.J Appl Nutr.2745-50；Hartwell，J.L.1976.Types of anticancer agents isolated from plants.Cancer Treat Rep.601031-1067；Scarpato，R.，Bertoli，A.，Baccarati A.et al.1998.Different effects of newly isolated saponins on themutagenicity and cytotoxicity of the anticancer drugs mitomycin C andbleomycin in human lymphocytes.Mutat.Res.42049-54)。
皂苷作為增強劑與醛類聯合使用以控制植物和動物病原體，參見美國專利No.5,639,794。絲蘭萃和Y.Hedera的提取物在控制非水蝸牛和鼻涕蟲上是有效的，參見美國專利No.5,290,557。很顯然，加入皂苷可幫助混合物控制在多種植物中發生的真菌性疾病和疫病(引自美國專利No.5,639,794和6,482,770)。但是，據我們所知，本發明是首次針對黃單胞菌相關的植物/作物疾病使用絲蘭萃提取物(含皂苷和其它成分)。
本發明的主要組分包括某些黃單胞菌屬種的主要提取物。用于本發明的具體菌種包括X.theicola和X.codiaei。使用這些有機體是基于如上文所述使用熒光假單胞菌(P.fluorescen)的外膜組分在農作物中誘導ISR所觀察到的原理。與革蘭氏陰性菌病原體相互作用的動物和植物宿主均取決于一連串事件。脂多糖在誘導高敏反應和ISR上極其有效。本領域的普通技術人員將會認識到可使用更密切相關的目標宿主特異性疾病的這類提取物。但是，本研究提供的證據表明X.theicola和X.codiaei的提取物可在多種植物(即柑橘、西紅柿和甘蔗)中引起高敏反應(HR)。另外，考慮到可能轉化為感染性植物病原體，使用這些相對安全的非致病性黃單胞菌屬種更為環保。
發明內容
本發明由將哈茨木霉菌、絲蘭萃、X codiaei和X theicola的提取干物質復水形成生物免疫-攻擊素，該攻擊素引起針對致植物病的黃單胞菌的植物細胞宿主的先天性防御。生物免疫-攻擊素指分散可引起入侵/暴露的宿主植物的天然防御的因子以對抗入侵的病原體的試劑。提取物可在多種鋪展劑/粘著劑中復水，用于噴霧、滴注或種子處理。盡管可使用多種鋪展劑/粘著劑，我們發現非離子性粘著劑SS 9(AgProSystems，Inc.)效果良好。本發明旨在提供易感植物免受黃單胞菌感染的保護作用。所提及的對易感植物的保護包括但不限于西紅柿、柑桔(橙子、酸橙、柚子)、胡蘿卜、甘蔗、假荊芥和大豆。
本發明的原理是提供環保的和不毒害植物的生物控制劑，該生物控制劑可預防和/或降低在農作物和植物上的致植物病的黃單胞菌屬種所引起的損害。“生物控制劑”意為通過使用從有生命的有機體提取的天然產物，利用其對病原體感染的直接抗病活性和/或誘導的宿主植物的抗性，控制植物病原體。“天然產物”為天然來源的有機化合物，它在某一種有機體中是獨特的，或者是少量緊密相關的有機體所共有的(包括所述有機體的二級代謝物)。
因此，本發明包括具有該特征、性質的物質的組合物以及將會在后文描述的組合物中所示例的組分之間的關系，本發明的范圍將在權利要求書中指明。
具體實施例方式 采用不同的方法提取和制備哈茨木霉菌、絲蘭萃、X codiaei和Xtheicola的提取物，但是，該提取方法一般為微生物領域的大部分技術人員所使用。同樣，提取干物質的組合遵循重組形成終試劑的特定模式。
A.所使用的相關試劑的限制性分析 1.真菌提取 從佛羅里達州的拉哥的Venture Biodiscovery獲得哈茨木霉菌的原始菌株(MBMH-21)。該菌株是在1998年和1999年的夏季從德克薩斯州的米申的柑桔林中所獲得的土壤樣品中分離得的。但是，我們發現可容易地使用多種哈茨木霉菌菌株。本發明的該產物的應用使用了ATCC的哈茨木霉菌(No.20873)。本發明中所使用的哈茨木霉菌菌株由微生物學家鑒定，并且將其形態學、化學和生長特征與從ATCC獲得的哈茨木霉菌的典型菌種(它們也可用于本發明)(NO.20873、20848和20846)進行了比較。
本發明所使用的哈茨木霉菌的所有菌株均在液體培養基和固體培養基中培養。所使用的固體培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato-Dextrose Agar，PDA)。為將我們的制品能用在商業上，該有機體通過常規發酵方法在液體培養基中生長，該液體培養基(pH6.8)由Czapec培養基組成，并添加了10％(w/v)的葡聚糖和0.1％(w/v)殼多糖組成。發酵在20L自動滅菌Nalgene瓶中進行，28℃一直攪拌。生長期取決于從固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)所獲得的培養物的原始接種物的多少。基本上，初始接種物為2.8g/L。本領域的普通技術人員很易發現可使用其它發酵培養基以實現大規模培養哈茨木霉菌。
在達到為獲得最初穩定期的培養時間后，6000×g離心收集菌絲體，并將所得到的上清液與沉淀小心分離開。用50mM磷酸鹽緩沖液充分洗滌回收得到的沉淀。回收得到的物質125℃干燥3到6個小時。同時，合并回收得到的上清液，4℃儲存備用。
步驟A.上清液的抽提 在4℃時用硫酸鋁(飽和度為80％)沉淀法處理回收得到的上清液，并通過離心回收沉淀，然后用50mM乙酸鉀緩沖液(pH5.5)徹底透析。采用De La Cruz等人所描述的方法(De La Cruz，J，Pintor-Toro，J.A.，Benítez，T.，and Llobell，A.1995.Purification andcharacterization of an endo-β-1，6-glucanase from Trichodermaharzianum that is related to its mycoparasitism.J.Baceriol.1771864-1871)將所得到的透析物用乙醇沉淀的石耳素處理。離心回收被石耳素所吸收的物質，70mM磷酸鹽緩沖液(pH6.0)洗滌沉淀，并用添加了1mM苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)和1mM疊氮化鈉的50mM乙酸鉀緩沖液重懸。37℃過夜孵育混合物，并且一直攪拌。將石耳素消化后，把混合物12,000×g離心10分鐘。然后將澄清的溶液用25mM咪唑-HCl緩沖液(pH7.4)透析。4℃下使用氮氣將回收得到的透析液使用Amicon超過濾單位中的PM-100 Amicon膜濃縮10倍。回收得到的濃縮物真空干燥，-80℃保存，用以檢測葡聚糖酶活性。采用De La Cruz等人所描述的方法對β-1，3-葡聚糖酶和β-1，6-葡聚糖酶進行檢測(上文已引用)。
步驟B干菌絲體的提取 液氮冷凍40g到150g(干重)物質并用組織碾磨器碾磨，然后破裂物質。兩種抽提均在干物質上進行。將該物質加入1L由乙氰和乙醇(3∶1)組成的有機溶劑，并在室溫下孵育2.5到4小時，然后離心。所回收得到的抽提物30,000×g離心30分鐘，并小心去除上清液。
真空干燥上清液。采用標準方法(Burdon，R.H.and P.H vanKnippenberg(Eds)Laboratory techniques In Biochemistry andMolecular Biology，Volume 17Application of HPLC in Biochemistry.1987.ElsevierNew York)將干的殘留物進行蛋白質、碳水化合物、類固醇以及脂質分析。采用Jones和Hancock的方法(Jones，R.W andHancock，J.G.1987.Conversion of viridin to viridiol by viridinproducing fungi.Can.J.Microbiol.33913-966)將提取物進一步進行綠毛菌醇分析。采用Brükner所描述的方法(Brükner，H.1984.Methods for the rapid detection，isolation and sequence determinationof Peptaibols and other aib-containing peptides of fungal orgin.Chromatographia 19188-199)對哈茨木霉菌培養物的提取干物質進行哌珀霉素分析。
在配備ISCO V4檢測器的ISCO 2360 HPLC系統上進行色譜分析。使用前文提及的參比物、膠霉毒素、綠膠霉素、綠毛菌醇和萜烯七酯酸，在所建議的參比柱上使用優選的洗脫流動相進行分級分離。回收樣本的分析結果在表1中示出。
2.絲蘭提取法 盡管本領域普通技術人員知道可以購買多種絲蘭萃提取物，但是在我們的制劑中，我們優選使用絲蘭萃幼苗(平均高度大約≤1m)的葉和根。德克薩斯州的Willis的Emerald莊園收集了絲蘭萃的葉和根樣本并提供給我們。
使用最少量的水在碾磨器中將新鮮葉初步碾磨。破裂后，加入100mL 95％乙醇，然后在4℃下使用碾磨器再次將該葉破裂20分鐘。該提取之后，使用No.2 Whatman針頭式過濾器過濾該勻漿物，并在4℃將濾液20,000×g離心20分鐘。去除所得到的上清液，并使用BüchiR-300 Rotavapor蒸發器進行低溫蒸發(30℃)。所得到的殘留物用40％乙醇重懸，并在4℃儲存備用。
使用相同的方法用小刀將絲蘭萃的根初步切碎，然后與相同體積的甲醇∶丁醇(1∶1v/v)一起放入剪切碾磨器。勻漿后，如上文所述將物質離心并過濾。過濾之后，如上文所述將所得到的濾液蒸發。使用最少量乙醇回收該殘留物，并在4℃儲存備用。
我們對這些提取物的主要關注在于類固醇類的皂苷。盡管本領域的普通技術人員可想到相當多用于定性分析皂苷部分的方法，但是我們還是采用了Wei的方法(Wei，J.1998.Determination of steroidalsaponins in Rhizoma prides by UP-HPLC.Yak Xu Bad 33465-468)。在上文所描述的ISCO系統上，使用對稱的C8柱進行色譜分析。用于分離的流動相為流速為1.0mL/min的乙氰∶水(42∶58v/v)。洗脫物在203nm檢測。
回收了大量的皂苷。基于該分析(一直進行著)，鑒定出幾種已知的皂苷，并且在特征上它們與已出版的報道中所回收到的絲蘭萃中的皂苷沒有差異。本發明所使用的皂苷參見表2。
除了皂苷，絲蘭萃含有多種活性成分。我們現在檢測這些具有生物活性的化合物，為的是進一步支持本發明的目的。
3.黃單胞菌屬種提取 根據本發明，我們使用了X codiaei和X theicola。這些微生物易于從很多細胞保藏機構獲得。在本發明中，我們集中在使用采用標準方法獲得的細菌膜片段的提取物。首先在固體73 YGC瓊脂上培養所使用的黃單胞菌屬種。為大規模生產，有機體分別在由10g/L酵母提取物、10g/L葡萄糖、5g/L CaCO3和0.1g/L酪蛋白組成的液體培養基(pH6.8)中通過發酵培養。盡管在該發酵過程中可使用其它液體培養基，但是在本發明中所使用的培養基效果很好。如上所述，發酵在Nalgene瓶中進行，并且最初的接種物由3.1g/L YGC瓊脂培養得到的相關細菌組成。在25℃持續攪拌下進行發酵。采用4℃下4,000×g離心20分鐘回收相關細菌。使用10mM HEPES緩沖液(pH7.4)將回收得到的細菌洗滌兩次，然后將回收得到的沉淀在-80℃儲存，用以采用Vesy等人的方法(Vesy，C.J.，Kitchens，R.L.，Wolfbauer，J.J.et al.2000.Lipopolysaccharide-binding protein and phospholipid transferprotein release lopopolysaccharides from gram-negative bacterialmembrances.Infect.Immun.682410-2417)進行膜提取。采用已經建立的方法(Burdon，R.H.and P.H van knippenberg(Eds)1987.Laboratory techniques In Biochemistry and Molecular Biology，Volume 17Application of HPLC in Biochemistry.ElsevierNew York；Work，T.S.and E.Work(Eds.)1982.Laboratory techniques inBiochemistry and Molecular BiologyTechniques of Lipidology.ElsevierNew York)對回收得到的脂相關物質進行分析。
在平行實驗中，可采用Severn等人所描述的熱酚提取法(Severn，W.B.，Kelly，R.F.，Richards，J.C.，and Whitfield，C.1996.Structure ofthe core oligosaccharide in the serotype O8 lipopolysaccharide fromKlebsiella pneumoniae.J.Bacteriol.1781731-1741)從黃單胞菌屬種中鑒定脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。
通過我們的提取方法，可回收大量脂質、磷脂和脂多糖。由于已知脂多糖(LPS)加重了病原體的攻擊，因此我們集中對在本發明中所使用的黃單胞菌屬種的LPS進行表征。對所回收到的LPS的闡述有一定的局限性，原因在于被表征的LPS是黃單胞菌屬種的天然組分，而不是純的化學物質。盡管一些黃單胞菌屬種的一些LPS組分已經被表征(Ojanen，T.，Helander，I.M，Haahtela，H.，et al.1993.Outermembrane proteins and lipopolysaccharides in pathovars ofXanthomonas campestris.Appli.Environ.Microbiol.594143(Abstr.))。可鑒定組分的結果參見表3；但是，現在正對更多具體產物的分析進行研究。
表1.哈茨木霉菌(ATCC 20873)的被選組分的濃度
＝物質被進一步分析。
＝未檢測。
表2.在絲蘭萃的葉和根的提取物中回收得到的皂苷
＝未檢測 表3.合并的Xanthomonas theicola和Xanthomonas codiaei的脂提取物 a數據用所鑒定的總脂肪酸的摩爾百分比表示。i＝同 B.生物免疫-攻擊素的制劑(“本發明”) 本發明包括下列有關的生物提取物的適當混合 1.制備哈茨木霉菌本方法的第一步是如上所述在發酵環境下大量培養哈茨木霉菌。培養有機體一直到到達生長的最初的穩定期，這通過蛋白濃度測定。如上所述，離心收集菌絲體。如上文所述，將所回收得到的沉淀用液氮冷凍并進行用組織碾磨器碾磨，然后將物質破裂。使用回收物的多個樣本用乙氰和乙醇(3∶1)抽提勻漿液，比率為400到600g勻漿液(濕重)/每升溶劑。提取物在一直攪拌最高達5個小時的條件下制備得到。將回收得到的提取物在4℃下30,000×g離心30分鐘，并小心去除上清液。合并回收得到的上清液并真空干燥。干燥條件下保存該物質(在本文中稱為THM)，以備用于下文所描述的制劑中。
2.制備絲蘭萃提取物如上文所述將絲蘭萃的葉和根破裂。簡單地說，先將60到90g剪碎的葉懸浮于最少量的水中，然后用碾磨器在4℃下破裂。加入100mL 95％乙醇，然后在4℃下再次在碾磨器中破裂20分鐘。該抽提后，用No.2 Whatman針頭式過濾器過濾該勻漿物，并在4℃下將濾液20,000×g離心20分鐘。去除所得到的上清液，并使用Büchi R-300 Rotavapor蒸發器進行低溫蒸發(30℃)。保存所得到的干物質(本文中被稱為YSL)，以備用于最終的制劑中。
使用相同的方法用小刀將絲蘭萃的根初步切碎，然后與相同體積的甲醇∶丁醇(1∶1v/v)一起放入剪切式碾磨器。勻漿后，如上文所描述將物質離心并過濾。過濾后，如上文所述將所得到的濾液蒸發。干燥保存所回收的殘留物(本文中被稱為YSR)，以備用于最終的制劑中。
3.制備黃單胞菌屬種用上文所述發酵方法分別培養X.theicola和X.codiaei。離心收集細菌，并將每一個種所回收得到的沉淀在FrenchPress中分別破裂。合并回收得到的物質并在一直攪拌的條件下用乙氰∶乙醇(3∶1)抽提4到6個小時。如上文所述將提取物離心并將所得到的上清液真空干燥。干燥保存回收得到的殘留物(本文中被稱為XSE)，以備用于最終的制劑中。
制備了產品的各種制劑，以鑒定在控制實驗室實驗中在預防或治療黃單胞菌感染上有效的濃度。制劑如下列所示有所不同 制劑I##THM∶YSL∶YSR∶XSE##∶1∶1∶1∶1(干重，w/w/w) 制劑II##THM∶YSL∶YSR∶XSE##0.5∶1∶1∶1(干重，w/w/w) 制劑III##THM∶YSL∶YSR∶XSE##1∶1∶0.5∶0.5(干重，w/w/w) 制劑IV##THM∶YSL∶YSR∶XSE##1∶0.5∶0.5∶1(干重，w/w/w) 制劑V##THM∶YSL∶YSR∶XSE##0.5∶0.1∶0.2∶1(干重，w/w/w) 制劑VI##THM∶YSL∶YSR∶XSE##0.5∶0.1∶0.1∶1(干重，w/w/w) 根據給定比率將本發明的上述制劑混合。懸浮該制劑，用選擇性粘著劑/鋪展劑懸浮制劑以最終使用。使用SS9(AgroPro Systems，Inc.)我們獲得了很大成功；但是我們使用了其它的粘著劑/鋪展劑。不引起可觀察到的植物毒性的每一種制劑的有效濃度確定如下 制劑I∶0.2g到1g/加侖鋪展劑/粘著劑 制劑II0.2g到1g/加侖鋪展劑/粘著劑 制劑III0.3g到2g/加侖鋪展劑/粘著劑 制劑IV0.2g到2g/加侖鋪展劑/粘著劑 制劑V0.5g到5g/加侖鋪展劑/粘著劑 制劑VI0.5g到5g/加侖鋪展劑/粘著劑 將制劑加入鋪展劑/粘著劑并用手攪拌。大部分制劑易溶于SS 9中，但是濃度達到1g/加侖SS9的制劑1導致大量泡沫的形成。但是，可通過加入恰當的抗沫劑減少泡沫。
植物毒性檢測 黃單胞菌感染大量農作物。我們的主要興趣是使用本發明對各種破壞性黃單胞菌感染提供保護。因此，我們已將本發明的多種制劑噴灑在多種農作物中，例如西紅柿(Lycopersicon esculentum)、橙樹(Citrussinensis)、葡萄柚(Citrus paradisi)、胡蘿卜(Daucus carota)、萵苣(Lactuca sativa)、柿子椒(Capsicum annuum)，最近也用于甘蔗(Saccharum officinarum)中。
植物毒性研究仍在進行。每個月都使用本發明的多種制劑對這些植物品種進行噴灑，每一種制劑噴灑不同品種。該檢測是季節性的，檢測了很多特征。盡管試驗組與對照組相比，在秋天和春天處理柚子樹和橙樹的幼苗和成株并未表現出任何降低水果產量或延緩生長速度的跡象，本研究還進一步進行。
同樣，在春天和秋天對柿子椒、蘿卜和萵苣進行噴灑對這些蔬菜的生長或產量沒有不良作用。一些證據表明對辣椒而言，產量似乎更高。但是，該研究仍在進行之中。
實施例 實施例1高敏反應的離體篩選 在柑桔屬種原生質體上進行針對本發明的高敏反應以及病原體攻擊。愈傷組織的原生質體來源于甜橙(citrus sinensis)、葡萄柚(citrusparadisis)和檸檬(citrus limon)的嫩枝條，并采用已建立的方法(Kyte，L and Kleyn，J(eds.)1996.Plants from test tubesAn introduction tomicroporpagation.3th Edition.Timber PressPortland，Oregon)常規制備。來源于所需柑桔屬種移植物的愈傷組織來源的細胞和原生質體按如下方法制備培養愈傷組織細胞，然后用3％纖維素酶、0.5％軟化酵素(macerase，溶于0.5M的甘露醇和蔗糖，最終滲透壓為825mmole/kg)消化。在KM8p原生質體培養基中培養回收得到的原生質體。
將剛分離得到的原生質體(回收后48小時內)用于試驗和對照研究。所選的所需原生質體的培養物暴露于多種濃度的不同制劑以及不同濃度的活性成分中。同樣，吐溫80、兩性霉素B和核黃素也用于鑒定它們由陽性對照和陰性對照的原生質體釋放過氧化氫(H2O2)的能力。采用已建立的方法(Jabs，T.，Tschpe，M.，Colling，C.，et al.1997.Elicitor-stimulated ion fluxes and O2 from oxidative burst are essentialcomponents in triggering defense gene activation and phytoalexinsynthesis in parsley.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 944800-4805)通過檢測由鐵氰化物所催化的魯米那氧化產生的化學發光，檢測試驗組和對照組的培養基中過氧化氫的產量。原生質體的活性通過二醋酸酯熒光素和碘化丙錠染色檢測。
本發明使用甜橙、葡萄柚和檸檬的原生質體。本發明確實合成了相對大量的H2O2到原生質體的培養基中。在多數情況下，所使用的原生質體的結果在所使用的不同原生質體培養基之間相差不大。但是，就本發明的實施例1而言，我們提供了使用甜橙的原生質體的研究的結果。H2O2產生的結果參見表4。
基于已知的XACE的蛋白濃度，病原體地毯黃單胞菌柑桔致病變種(X.axonopodis[pv.]citri，XACE)(由德克薩斯大學的Marion Levy博士提供)的提取物終濃度在60μg/mL。如上文所述檢測過氧化氫的釋放。結果參見
圖1。
表4.暴露于本發明并攻擊了不同時間后甜橙的原生質體的培養基中過氧化氫的累積
不能檢測。
＝以脂類濃度為基礎。§＝以特定重力為基礎。
在平行試驗中，甜橙的原生質體培養物暴露于10μg/mL本發明的制劑V中4小時。通過瞬時離心回收原生質體，用原生質體培養基洗滌，重懸于新鮮培養基中并再培養24小時。培養后，將甜橙原生質體暴露給外膜。
圖1.在加入XACE前用本發明(制劑V)處理的原生質體培養基中的過氧化氫的產量。實心三角形代表在重懸前用制劑V處理、不暴露于任何其它活性試劑的原生質體(對照組)。空心方塊代表僅僅暴露于XacE.的原生質體。實心方塊代表在給定時間內暴露于XacE前先用制劑V處理的原生質體。
盡管用于研究的黃單胞菌屬種的使用以及流通受到美國農業部動植物衛生檢疫局嚴格限制，但是我們僅僅使用易獲得的黃單胞菌病檢測本發明。目前，我們已許可將我們的產品用于抗柑桔潰瘍和其它嚴重的黃單胞菌相關疾病的試驗中。
同樣，上文所描述的多種制劑已被用于這些研究中。但是，僅僅給出了制劑V的數據。其它制劑有著相似的結果；但是，當制劑V被加入本發明所用的鋪展劑和粘著劑時，它具有較少的泡沫問題。
實施例II對黃單胞菌誘導的假荊芥的葉斑病的控制 將假荊芥(Nepeta cataria)用包括野油菜黃單胞菌的多種細菌引起葉斑病。為了檢測本發明的混合物對黃單胞菌所引起的疾病的有效性，我們使用了假荊芥模型。位于德克薩斯州的Willis的可控溫室中，我們在盆里種植了28棵2個月大的假荊芥。該植物被分為試驗組和對照組，每組有4棵。試驗前48小時，每組均放置于充滿濕氣的濕室里。
在攪拌下于營養培養基中將野油菜黃單胞菌培養48小時，并稀釋成為106CFU/mL的懸浮液，這通過平板培養法檢測。將吐溫20加入細菌懸浮液中，使其終濃度為0.5％。使用手持式彌霧器，用細菌混合物噴灑植物。每隔一天檢查一次植物發病情況。
在兩個星期內，在幾棵試驗植物上觀察到葉斑病的小的褐色斑點。一個星期后，斑點的大小發展成為較大的角狀褐色斑點，這與在假荊芥的葉斑病所觀察到的共有特征相似。分組，并在出現斑點到大量壞死的各個階段進行處理。
在觀察到疾病特征和惡化之后，我們在如下條件下使用了本發明的混合物。制備制劑V，使其終濃度為0.5g制劑/加侖SS 9。對照組僅用SS-9處理。本試驗后，將植物及其塑料盆燒掉。將種植所有植物的盆里的土壤高壓滅菌，并將充滿露水的室消毒。結果在表5中列出。
如表5所示，對感染早期的植物用制劑V噴灑兩個星期，阻斷了疾病的發生。在該處理后一個月在這些植物中均沒有觀察到疾病的征象。同樣，暴露于制劑V之前表現出一定壞死的植物在以制劑V噴灑后2周內表現出感染減少并且有恢復過程。處理后4個星期內，未觀察到明顯發病，并且未觀察到褐色斑點。
同樣，制劑V對表現出較高水平壞死的假荊芥樣本提供保護。用制劑V處理后三個星期內，在壞死恢復中觀察到效果顯著提高，并且在用制劑V噴灑后四個星期內觀察到完全康復。
相反，僅僅用SS-9處理不對被感染的假荊芥提供保護。如圖5所示，疾病快速惡化，因此，由于疾病的快速惡化，結束對照組實驗。
在平行試驗中，如上所述，用制劑V噴灑總共8棵2個月大的植物。噴灑一個星期后，用上文所給定的濃度和條件用野油菜黃單胞菌感染植物。如上所述，結束所有的對照組實驗和實驗組實驗，并將其破壞。本試驗的結果在表6中列出。
如表6所示，在野油菜黃單胞菌感染前，用制劑V對假荊芥植物噴灑一個星期提供了針對該細菌的保護。相反，僅僅用SS-9噴灑的植物病情得以惡化。
實施例3對黃單胞菌殺傷早熟禾的控制 除了檢測黃單胞菌感染假荊芥的效果外，我們使用了一年生莓系屬的牧草早熟禾，以檢測本發明的混合物對用野油菜黃單胞菌早熟禾致病變種(Xanthomonas campestris[pv.]poannua，作為XPO從EcoSoil Systems獲得)感染的該牧草的效果。在該研究中，早熟禾在開放式植物生長盒(Phytatray，Sigma)中生長。該生長盒分為對照組(N＝10盒)和實驗組(N＝10盒)。生長一個月后，根據產品說明書，用野油菜黃單胞菌早熟禾致病變種噴灑試驗組生長盒。感染后，我們等待對該牧草的損傷的出現，然后用上文給出的制劑V噴灑。對照組為不用制劑V處理或僅僅用SS-9處理。結果在表7中列出。
如表7所示，制劑V使牧草的疾病免于惡化。對表現出最小損傷的植物的效果在噴灑制劑V后一個星期內提供了保護。同樣，表現出中度損傷的植物可得到治療并且在暴露于制劑V后兩個星期內免于感染疾病。表現出受野油菜黃單胞菌早熟禾致病變種較高程度的損傷的植物在暴露于制劑V后三個星期內免于感染疾病。相反，在僅僅用SS-9噴灑前表現出中度疾病癥狀的牧草未能提供免受野油菜黃單胞菌早熟禾致病變種感染的保護。
在平行試驗中，在用野油菜黃單胞菌早熟禾致病變種感染前，我們用制劑V對健康的牧草噴灑了一個星期，以確定本發明對該牧草提供預防保護使其免受該病原體感染。試驗結果在表8中列出。
如表8所示，在暴露于病原體前用制劑V噴灑牧草提供了保護。相反，與未用任何制劑(除了含病原體的制劑)所噴灑的被感染的植物相比，僅僅用SS-9噴灑的牧草不會得到保護并且表現出疾病的惡化。
表5.使用本發明的混合物制劑V對假荊芥的黃單胞菌感染的控制
用病原體噴灑有斑點的植物，并在噴灑前一直培養到出現所需病變。按照如下所示分析反應3+過度壞死；2+一定程度的水漬壞死；1+觀察到一定的斑點；
＝恢復證據表明疾病沒有惡化；
＝表明由于疾病的進展階段，除去植物并焚燒。
圖6.在假荊芥中混合物在阻止野油菜黃單胞菌感染的有效性
在植物接受足量的制劑V后用細菌噴灑有斑點的植物一個星期。按照如下所示分析反應3+過度壞死；2+一定程度的水漬壞死；1+觀察到的一定程度的斑點；
＝恢復證據表明疾病沒有惡化；
＝表明由于疾病的進展階段，除去植物并焚燒。
表7.使用混合物制劑V對在早熟禾中的黃單胞菌感染的控制
用病原體噴灑種植牧草，并在制劑V噴灑前一直培養到出現所需病變。按照如下所示分析反應3+過度褐變、壞死；2+高度褐變、萎縮；1+觀察到一定程度的褐變；
＝愈合證據表明疾病沒有惡化；
＝表明植物死亡。
表8.混合物在早熟禾中阻止黃單胞菌感染的有效性
在用病原體接種前用制劑V噴灑種植牧草。按照如下所示分析反應3+過度褐變、壞死；2+高度褐變、萎縮；1+觀察到一定程度的褐變
＝恢復證據表明疾病沒有惡化；
＝表明由于疾病的進展階段，除去植物并焚燒。
因此可見上述目的與通過上述說明變得顯而易見的目的一樣可有效實現，并且在不背離本發明的范圍下，可對上述物質的組成作出某些改變，因此上文描述中所包含的所有物質旨在進行示例性闡述，而非限制。
還需要理解的是下面的權利要求旨在囊括本文所描述的發明的普遍特征和特定特征，并且所有對本發明范圍的描述通過語言落入其中。特別地，應該理解的是在所述權利要求書中，只要條件允許，單數形式敘述的組分或化合物旨在包括該組分的相容混合物。
已對本發明進行了描述。
權利要求
1.一種在農作物中治療黃單胞菌屬種感染的組合物，所述組合物包括以重量計約0.5-1.0哈茨木霉菌，以重量計約0.1-1.0絲蘭萃根部提取物，以重量計約0.1-1.0絲蘭萃的葉提取物，以及以重量計約0.5-1.0黃單胞菌屬種提取物。
2.根據權利要求1的組合物，包括以重量計約1.0哈茨木霉菌，以重量計約1.0絲蘭萃根部提取物，以重量計約1.0絲蘭萃的葉提取物，以及以重量計約1.0黃單胞菌屬種。
3.根據權利要求1的組合物，包括以重量計約0.5哈茨木霉菌，以重量計約1.0絲蘭萃根部提取物，以重量計約1.0絲蘭萃的葉提取物，以及以重量計約1.0黃單胞菌屬種。
4.根據權利要求1的組合物，包括以重量計約0.5哈茨木霉菌，以重量計約0.5絲蘭萃根部提取物，以重量計約1.0絲蘭萃的葉提取物，以及以重量計約0.5黃單胞菌屬種。
5.根據權利要求1的組合物，包括以重量計約1.0哈茨木霉菌，以重量計約0.5絲蘭萃根部提取物，以重量計約0.5絲蘭萃的葉提取物，以及以重量計約1.0黃單胞菌屬種。
6.根據權利要求1的組合物，包括以重量計約0.5哈茨木霉菌，以重量計約0.2絲蘭萃根部提取物，以重量計約0.1絲蘭萃的葉提取物，以及以重量計約1.0黃單胞菌屬種。
7.根據權利要求1的組合物，包括以重量計約0.5哈茨木霉菌，以重量計約0.1絲蘭萃根部提取物，以重量計約0.1絲蘭萃的葉提取物，以及以重量計約1.0黃單胞菌屬種。
8.一種在農作物中治療黃單胞菌屬種感染的方法，所述方法包括將權利要求1的組合物通過噴灑用于被感染的農作物。
9.一種提高農作物對黃單胞菌屬種感染的抗性的方法，所述方法包括將權利要求1的組合物通過噴灑用于農作物。
全文摘要
一種治療農作物中黃單胞菌屬種感染的組合物，其中該治療組合物是哈茨木霉菌、絲蘭萃根部提取物、絲蘭萃葉提取物和黃單胞菌屬種提取物的混合物。該組合物作為提高農作物對這種感染的抗性的預防感染試劑也是有效的。該組合物優選通過噴灑使用。
文檔編號A01N25/26GK1901797SQ20048004020
公開日2007年1月24日 申請日期2004年12月17日 優先權日2004年1月9日
發明者R·M·希斯米思 申請人:生物系統公司