專利名稱：抗黑腐病花椰菜品種早期篩查試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術中的分子標記輔助早期篩查抗黑腐病花椰菜新品種的試劑盒及其利 用該試劑盒進行檢測的方法。
背景技術：
花椰菜黑腐病是由黃單胞桿菌屬甘藍黑腐黃單胞菌甘藍黑腐致病變種[ZaW/jo/m)w^ ca/ ^e欲!;ypv. cflw; e欲W Pam.) Dowson]侵入所致，屬于世界性的重要細菌性病害。花椰菜黑 腐病主要危害葉片或花球。幼苗受害時，子葉染病呈水漬狀，逐漸變褐枯死；真葉染病，病菌 由水孔侵入的引起葉緣發病，呈V字形病斑。成株期發病，病菌從葉緣水孔和傷口侵入，除葉 緣形成向內擴展的V字形枯斑外，病菌沿葉脈向下擴展,形成較大壞死區或不規則黃褐色大 斑，病斑邊緣葉片組織淡黃色。該病流行時，葉緣多處受侵，造成外葉局部或全部腐爛，使葉 片失去管和作用功能。病斑干枯或形成穿孔后，病菌進入莖部維管束后，在莖部逐漸蔓延，可 及葉柄與葉脈處，引起植株萎蔫。花球受害時，病菌先從花梗侵入，顏色變成灰黑色，并逐漸 蔓延到花球，呈灰黑色干腐狀。最后植株全部死亡。
近年來，菜田復種指數普遍提高，加之生態條件改變和境外大量引種及廣泛種植,又隨著 連作年限時間的延長，花椰菜黑腐病植株發病率越來越高，危害日趨嚴重，且黑腐病危害期長， 在花椰菜的整個生長期均可發生，該病大流行使蔬菜的產量和品質急劇下降，給生產造成巨 大損失。嚴重年份發病率高達60% 80%,直接影響花椰菜的產量和品質，給花椰菜的生產造 成極大危害和經濟損失。
我國十分重視花椰菜的抗黑腐病育種，通過常規育種，與抗病品種雜交和多代自交，選 育出一批具有高抗和中抗的花椰菜品種，在生產上發揮了重要的作用，但由于選育周期較長， 而且還消耗了大量的土地、人力和物力，所篩選出的品種遠遠不能滿足生產上的需要。因此， 依托生物技術，充分利用DNA分子標記遺傳穩定性高，不受取材部位、時間、發育時期和環 境的影響，操作簡單、耗時少的優勢，建立能在苗期就可對花椰菜抗、感黑腐病性狀進行大 規模篩查的方法，對抗黑腐病花椰菜新品種的選育具有重要意義。
有關花椰菜黑腐病的研究國內外報道很少，利用分子標記輔助花椰菜進行抗病育種方面 的研究未見報道。利用特異分子標記進行早期篩選的關鍵是篩選到與抗病相關的特異標記。
發明內容
本發明的目的是克服常規抗黑腐病花椰菜選種技術的不足，提供一種快速、早期、大規 模篩選抗黑腐病花椰菜新品種或單株的試劑盒及其利用該試劑盒進行檢測的方法。
3本發明的技術方案概述如下
抗黑腐病花椰菜品種早期篩査試劑盒，它是由特異引物1 : TACTGGTGGCTGTAGATTATGT和特異引物2: AATGGCAAGGGTTCAAGGGTAGG; dNTP、 Taq聚合酶、PCR緩沖液、DNA模板、無菌去離子水、6x上樣緩沖液及標準陽性Marker組 成。
一種使用上述試劑盒在苗期對抗黑腐病花椰菜品種進行篩査的方法，它包括如下步驟 (l)一步法提取花椰菜基因組DNA; (2)基因組DNA的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測；(3) PCR擴增在PCR擴增專用的薄壁離心管中加入PCR緩沖溶液、dNTP、特異引物l、特 異引物2、花椰菜基因組DNA、 Taq聚合酶、無菌水補至25微升，將裝有上述液體的PCR 專用薄壁離心管放入PCR擴增儀中，擴增條件為94'C變性180秒，后進行94。C變性30秒， 52'C退火45秒，72'C延伸120秒的擴增循環，循環數為35個，最后在72'C延伸480秒，擴 增完成。(4) PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測配置1.2%的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入 溴化乙錠(0.5微克/毫升)；在5微升擴增產物及5微升標準陽性Marker中分別加入1微升6x 上樣緩沖液，混勻，用移液器將上述混合液分別加入浸沒0.5xTBE電泳液的瓊脂糖凝膠的點 樣孔中，80V恒電壓，電泳1800秒后停止電泳。凝膠直接在紫外燈下(紫外波長265nm)或 在凝膠成像儀器上進行觀察；(5)依照標準陽性Marker帶在凝膠上的遷移位置和PCR產物 的遷移位置判斷未知花椰菜抗、感黑腐病情況。
利用該技術的檢測結果與田間的吻合率達％%，而且具有簡便、快速、準確，不受生長 季節、環境條件等影響的特點，再定苗移栽前即可檢測，節省了大量土地、人力和物力，縮 短了選種的時間，在花椰菜抗病育種上具有重要的應用價值。
圖l是花椰菜已知抗、感黑腐病的電泳檢測結果 圖2是未知抗病性花椰菜田間隨機檢測的電泳檢測結果
具體實施例方式
下面結合實施例子和附圖對本發明做進一步的說明 實施例1
利用已知抗黑腐病和感黑腐病花椰菜植株進行檢測方法，包括以下步驟
(1)提取抗、感黑腐病花椰菜基因組DNA: 取幼嫩花椰菜葉片100mg，用剪刀將其剪碎 置于組織研磨器中，加入100pL提取緩沖溶液(1%SDS， 10mmol/L Tris,0.3mol/L EDTA，l%PVPP,pH8.0)，充分研磨成勻漿，然后加入400pL提取緩沖溶液，混勻后置9(TC水 浴中溫育20分鐘，期間要不時的顛倒搖勻，取出后置于冰浴中5分鐘，4'C保存備用。(2)DNA濃度的測定可采用兩種方法進行， 一是利用紫外分光光度計測量，二是利用自制的已
知標準的凝膠平板測量， 一般的濃度要求在200ng以上/pL即可。(3) PCR擴增在PCR 擴增專用的薄壁離心管中加入10xPCR緩沖溶液2.5pL、 10mmol/LdNTP0.5nL 、 10^irnol/L 特異引物1和2各lpL、花椰菜基因組DNA400ng、 T叫聚合酶2單位、無菌水補至25pL， 將裝有上述液體的PCR專用薄壁離心管放入PCR擴增儀中，擴增條件為94'C變性180秒， 后進行94'C變性30秒，52'C退火45秒，72'C延伸120秒的擴增循環，循環數為35個，最 后在72。C延伸480秒，擴增完成。(4) PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測配置1.2%的 瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入溴化乙錠(0.5微克/毫升)；在5微升擴增產物及5微升標準陽性 Marker中分別加入1微升6x上樣緩沖液，混勻，用移液器將上述混合液分別加入浸沒0.5xTBE 電泳液的瓊脂糖凝膠的點樣孔中，80V恒電壓，電泳1800秒后停止電泳。凝膠直接在紫外 燈下(紫外波長265nm)或在凝膠成像儀器上進行觀察；(5)依照標準陽性Marker帶在凝膠 上的遷移位置和PCR產物的遷移位置判斷花椰菜抗、感黑腐病情況。如圖1所示泳道1.-10 為已知抗黑腐病的花椰菜植株；11-20是己知感病的花椰菜植株，21為試劑盒提供的標準陽 性Marker為1700bp，圖2是田間隨機取材檢測的結果，隨機取樣的單株隨后進行大田抗黑 腐病性狀觀察大田觀察結果證實，有1700bp帶的是抗黑腐病的花椰菜植株，無1700bp帶 的是感病的花椰菜植株。
權利要求
1. 抗黑腐病花椰菜品種早期篩查試劑盒，其特征在于它由特異引物1、特異引物2、dNTP、Taq聚合酶、PCR緩沖液、DNA模板、無菌去離子水、6×上樣緩沖液及標準陽性Marker組成。
2. —種使用權利要求1的在苗期對抗黑腐病花椰菜品種進行篩査的方法，其特征是它包括如下步驟(1) 一步法提取花椰菜基因組DNA; (2)基因組DNA的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測；(3) PCR擴增在PCR擴增專用的薄壁離心管中加入PCR緩沖溶液、dNTP、特異引物l、特 異引物2、花椰菜基因組DNA、 Taq聚合酶、無菌水補至25微升，將裝有上述液體的PCR 專用薄壁離心管放入PCR擴增儀中，擴增條件為94'C變性180秒，后進行94'C變性30秒， 52。C退火45秒，72X:延伸120秒的擴增循環，循環數為35個，最后在72'C延伸480秒，擴 增完成。(4) PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測配置1.2°/。的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入 溴化乙錠(0.5微克/毫升)；在5微升擴增產物及5微升標準陽性Marker中分別加入1微升6x 上樣緩沖液，混勻，用移液器將上述混合液分別加入浸沒0.5xTBE電泳液的瓊脂糖凝膠的點 樣孔中，80V恒電壓，電泳1800秒后停止電泳。凝膠直接在紫外燈下(紫外波長265nm) 或在凝膠成像儀器上進行觀察；(5)依照標準陽性Marker條帶在凝膠上的遷移位置和PCR 產物的遷移位置判斷未知花椰菜抗、感黑腐病情況。
全文摘要
本發明公開了一個對花椰菜抗黑腐病新品種進行早期篩查的試劑盒和使用該試劑盒的檢測方法。試劑盒由dNTP、Taq聚合酶、PCR緩沖液、DNA模板、無菌去離子水、6×上樣緩沖液及標準陽性Marker組成。檢測方法包括以下步驟(1)花椰菜基因組DNA的一步法提取；(2)基因組DNA提取結果的瓊脂糖凝膠電泳檢測；(3)PCR擴增；(4)PCR擴增產物凝膠電泳檢測；(5)結果判讀依照標準陽性Marker帶在凝膠上的遷移位置和PCR產物的遷移位置判斷未知花椰菜抗、感黑腐病情況。利用該試劑盒篩查鑒定抗黑腐病花椰菜新品種或株系的結果與田間抗病性狀吻和率達96％以上。該試劑盒檢測具有簡便、快速、準確，不受生長季節、環境條件等因素的影響，且可在苗期就能完成篩查、鑒定，節省了大量土地、人力、物力，并大大縮短了選種時間，在花椰菜抗黑腐病育種上具有重要的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK101423868SQ20081015401
公開日2009年5月6日 申請日期2008年12月12日 優先權日2008年12月12日
發明者瑜 古, 孫德嶺, 宋文芹, 王春國, 擘 郝, 陳成彬 申請人:南開大學