激發水稻產生抗病反應的無毒基因avrxa5的制作方法

專利名稱：激發水稻產生抗病反應的無毒基因avrxa5的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術領域的基因，具體是一種激發水稻產生抗病反應的 無毒基因3KTxa5。
背景技術：
水稻白葉枯病由水稻黃單胞菌(Za/7t/ o/z cwas o/y^je pv. o/yzae)引起， 是我國水稻生產上重要的三大病害之一，常造成水稻減產5%-25%，嚴重時會導 致水稻絕收，嚴重制約著我國水稻的安全生產。白葉枯病菌與水稻互作符合"基 因-對-基因"關系，即在病原菌中存在一個無毒基因，則在水稻中存在一個匹配 的抗病基因。白葉枯病菌中的無毒基因可以激發水稻中的抗病基因活性，從而使 水稻產生抗病性。目前為止，在水稻白葉枯病菌中已經鑒別和明確無毒基因功能 的基因有a^fe7， a^fe"和a^fei7，它們分別對應水稻中的抗病基因是Ja7， Xa^ 和Xai^，但只有Ja^7抗病基因被鑒別出來。aKrJa7、 aKrJa70和aKrJai7 都屬于水稻白葉枯病菌中的aw^s3/尸t/^家族。白葉枯病菌中的無毒基因具有植 物抗病育種價值，而且具有分離和鑒別水稻抗病基因的功能，發掘可使水稻產生 抗病性的水稻白葉枯病菌中無毒基因具有重要的科學價值和實踐價值。
經對現有技術的文獻檢索發現，未發現與水稻隱性抗病基因,a5對應的無毒 基因ai^ra5"有關的報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一種激發水稻產生抗病反應的無毒基因aw;ra5。本 發明的無毒基因aKrjra5可以激發含有xa5基因的水稻產生對白葉枯病的抗病性。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明涉及的激發水稻產生抗病反應的
無毒基因3Kr;ra5具體是
本發明涉及的無毒基因sktxs5，其序列為SEQ ID NO. 1，序列長度為3717bp，
基因上的酶切位點與aK/^^/Z^^家族基因相同，102bp重復單元在基因內重復
數為19.5。
所述無毒基因SFr;ra5編碼1238個氨基酸，氨基酸序列為SEQ ID NO. 2，由102bp編碼的34個氨基酸重復單元在該蛋白中重復19. 5次。
所述無毒基因sw^a^在含有義s5基因的水稻上可激發產生對白葉枯病的抗病性。
本發明將水稻白葉枯病菌JXOIII菌株的基因組DNA通過fcoRI部分酶切， 構建在pUFR034載體上獲得了 JXOIII基因文庫，以aKr5sJ/Z^A4家族基因的保 守AcoRI-feMH片段為探針，Southern雜交篩選JXOIII基因文庫，獲得了含有 aw^^/尸f力力家族基因的陽性克隆。將陽性克隆逐一導入到水稻白葉枯病菌 PX099A菌株中，在水稻近等基因系成株期水稻上逐一剪葉接種相應的接合子，15 天后調查白葉枯病發病情況。調查發現，p46克隆能夠使PX099A菌株在含有;ra5 抗病基因的IRBB5水稻上由親和性互作轉變為非親和性互作，確定p46克隆中含 有aKTJ^5基因。經過亞克隆、BamHI酶切分析和Southern雜交驗證，獲得了 p4B 亞克隆。將p4B克隆導入PX099A菌株，剪葉接種IRBB5水稻，發現該亞克隆仍 能夠使PX099A菌株在含有；^5抗病基因的水稻品種表現為非親和互作關系，確 認p4B亞克隆中含有一種能夠激發水稻產生抗病反應且對應x35基因的無毒基因 s^ra5。序列測定分析后發現，p4B中含有aKTX35基因，符合aKr^^/尸t力//家 族基因的基本特征。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果將本發明獲得的a^ra5基因 導入水稻白葉枯病菌PX099A菌株中，可使含^^抗病基因的水稻產生抗病性反 應，白葉枯病菌不能侵染含有xa5抗病基因的水稻，從而有效防治白葉枯病菌對 水稻的危害。
本發明中所涉及的菌株JXOIII和PX099A己在文獻《Wu Xiaomin， Li Yurong，
Zou Lifang， and Chen Gongyou. 2007. Gene_for-gene relationships between
rice and diverse avrBs3/pthA avirulence genes in Xanthomonas oryzae pv.
oryzae. Plant Pathology, 56(1): 26—34》中公開。


圖1為aw，;ra5基因圖譜和結構示意圖2為3KT^^基因克隆示意圖3為aw^5基因在水稻上激發產生褐色過敏反應能力的測定；
圖4為aw;ra5基因在水稻上激發抗病性的能力測定。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而 不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例
歩驟一，水稻白葉枯病菌awvra5基因的克隆
水稻白葉枯病菌JXOIII菌株在含有xs5抗病基因的水稻IRBB5上表現為非 親和性互作。本研究以JXOIII為目標菌株，提取其基因組DNA，通過化oRI部 分酶切后構建于載體pUFR034載體上，獲得了 JXOIII基因文庫。圖1中，以 aw^sJ/,fA4家族基因保守的NLS區域DNA片段為探針，Southern雜交篩選 JXOIII基因文庫，獲得了含有家族基因的陽性克隆。圖1中，B 代表^3/in酶切位點，P代表尸stl酶切位點，S代表5^M酶切位點；縱隔表示 102bp重復單元，該單元在arrzs^基因中重復19. 5次；LZ代表亮氨酸拉鏈結構 域；NLS代表核定為信號，1，2，3表示NLS有3個；AD代表酸性轉錄激活域。
將陽性克隆逐一導入到水稻白葉枯病菌PX099A菌株中，在水稻近等基因系成株 期水稻上逐一剪葉接種相應的接合子，15天后調査白葉枯病發病情況。調查發 現，p46克隆能夠使PX099A菌株在含有^5抗病基因的水稻品種IRBB5上由親和 性互作轉變為非親和性互作，如圖4所示，確定p46克隆中含有對應m5的無毒 基因。
步驟二，水稻白葉枯病菌aw7a5基因的分離
對P46克隆中的1B-5B的5個Sa/zHI條帶進行回收，分別連接到經汲mHI 酶切的pUAV45K(B)載體上，獲得了相應的克隆plB、 p2B、 p3B、 p4B和p5B，如 圖2A所示。如圖2B所示，酶切和Sorthern雜交結果顯示，plB和p4B 克隆中含有arrfoJ/尸^4家族的基因。圖2中，圖2A為樣品1-8經皮』1酶切 后的瓊脂糖電泳圖，圖2B為對應樣品的Southern雜交圖。M為DNA Marker, 泳道1為p46，泳道2為plB，泳道3為p2B，泳道4為p3B，泳道5為p4B,泳 道6為p5B，泳道7為pUFR034，泳道8為pUAV45K。
步驟三，水稻白葉枯病菌s7r;^5基因的功能鑒別
為了證實上述2個克隆對含有義s5抗病基因的水稻具有激發抗病性的功能， 本研究將PlB和p4B克隆分別導入PX099A菌株中，獲得了接合子PX099A(plB)和
5PX099A(p4B)。用無針頭注射器將上述接合子注射接種到苗齡為15天的含有zs5 的IRBB5水稻和含有la5的IR24水稻上。褐色過敏反應為抗病反應，水浸癥狀 為感病反應。
圖3A為a^^^基因在水稻上產生水浸癥狀能力的測定，接種的菌株分別為 1為菌株PX099A， 2為菌株JXOIII， 3為菌株PX099A(p46) ， 4為菌株PX099A(plB)， 5為菌株PX099A(p4B)， 6為菌株PX099A(pUFR034)。 IR24為含有Zs5"基因的水稻 品種，IRBB5為含有iaS基因的水稻品種。
如圖3A所示，3天后發現，與JXOIII菌株和PX099A(P46)—樣，PX099'(p4B) 可在IRBB5的水稻上形成褐色過敏反應，而PX099A(plB)與同PX099A—樣僅能形 成水浸(water soaking)癥狀。在含有顯性抗病基因化5的水稻IR24上，無論 是JX0III菌株還是以PX099A為遺傳背景的接合子，則表現為水浸癥狀，如圖3A 所示，表明p4B中的無毒基因不是對應A5基因而是對應犯5基因。
圖3B為水稻白葉枯病菌在水稻IRBB5上生長能力的測定，圖3B中，a為菌 株PX099A(pUFR034)， b為菌株JXOIII， c為菌株PX099A(p46) ， d為菌株 PX099A(plB)， e為菌株PX099A(p4B)。如圖3B所示，和JXOIII菌株一樣，接合 子PX099A(p46)和PX099A(p4B)在水稻組織中的生長能力顯著下降，這表明含有 ^^基因的水稻因被激活了抗病性從而阻止了病菌的生長，進而標明對應罰5基 因的無毒基因為aKrxa^基因。
為了進一步明確aKrxa5在成株期水稻上的無毒基因功能，本研究將上述菌
株和接合子通過剪葉接種方式，分別接種在含有^^隱性基因和含有^J^顯性抗
病基因的水稻IRBB5和IR24上。圖4A為含有xs5隱性基因的水稻品種IRBB5;
圖4B為含有Zs5顯性抗病基因的水稻品種IR24。相應的水稻白葉枯病菌剪葉接
種成株期水稻，根據病斑長度確定aw罰5基因激發水稻產生抗病性的能力，相
應的接種菌株分別為1為菌株PX099A， 2為菌株JXOIII， 3為菌株PX099A(p46)，
4為菌株PX099A(plB)， 5為菌株PX099A(p4B)， 6為菌株PX099A(pUFR034) ， 7為
菌株PX099A(aKrZa;)。
結果發現，如圖4A所示，JX0in菌株、PX099A(p46)和PX099A(p4B)均能在
IRBB5上表現為非親和性互作，病斑長度不超過0. 5cra，而在IR24上表現為親和
性互作，病斑長度超過15cm，如圖4B所示。這表明，p4B中的無毒基因激發了
水稻IRBB5中抗病基因化5的活性，從而導致IRBB5水稻產生了抗病性。本發明獲得的aKTX35基因導入水稻白葉枯病菌PX099A菌株中，可使含J^5 抗病基因的水稻產生抗病性反應，使得白葉枯病菌不能侵染含有^^抗病基因的 水稻，從而有效防治白葉枯病菌對水稻的危害。序列表
SEQ ID NO. 1
〈110〉上海交通大學
<120>激發水稻產生抗病反應的無毒基因mrxc 5 <170〉 Patentln version 3. 5
<210〉 1
<211〉 3717
<212> DNA
<213> Xanthomonas oryzae pv. oryzae
〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (1)..(3717)
〈220>
<221〉 misc—feature <222〉 (866).. (2859)
<220〉
〈221〉 repeat—region
〈222〉 (866) . (2859)
<223〉 19.5
<220〉
〈221〉 repeat—unit 〈222〉 (866)..(967) 〈223〉
CAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCC
〈400〉 1
atg gat ccc att cgt teg cgc acg cca agt cct gcc cgc gag ctt ctg 48 Met Asp Pro lie Arg Ser Arg Thr Pro Ser Pro Ala Arg Glu Leu Leu 15 10 15
ccc gga ccc caa ccg gat agg gtt cag ccg act gca gat egg ggg ggg % Pro Gly Pro Gin Pro Asp Arg Val Gin Pro Thr Ala Asp Arg Gly Gly 20 25 30get ccg cct get ggc ggc ccc ctg gat ggc ttg ccc get egg egg acg 144 Ala Pro Pro Ala Gly Gly Pro Leu Asp Gly Leu Pro Ala Arg Arg Thr 35 40 45
atg tec egg acc egg ctg cca tct ccc cct gcg ccc tcg cct gcg ttc 192 Met Ser Arg Thr Arg Leu Pro Ser Pro Pro Ala Pro Ser Pro Ala Phe 50 55 60
tcg gcg ggc age ttc age gat ctg etc cgt cag ttc gat ccg tcg ctt 240 Ser Ala Gly Ser Phe Ser Asp Leu Leu Arg Gin Phe Asp Pro Ser Leu 65 70 75 80
ctt gat aca tcg ctt ctt gat tcg atg cct gcc gtc ggc acg ccg cat 288 Leu Asp Thr Ser Leu Leu Asp Ser Met Pro Ala Val Gly Thr Pro His 85 90 95
aca gcg get gcc cca gca gaa tgg gat gag gcg caa tcg ggt ctg cgt 336 Thr Ala Ala Ala Pro Ala Glu Trp Asp Glu Ala Gin Ser Gly Leu Arg 100 105 110
gca gcc gat gac ccg cca ccc acc gtg cgt gtc get gtc act gcc gcg 384 Ala Ala Asp Asp Pro Pro Pro Thr Val Arg Val Ala Val Thr Ala Ala 115 120 125
egg ccg ccg cgc gcc aag ccg gcc ccg cga egg cgt gcg gcg caa ccc 432 Arg Pro Pro Arg Ala Lys Pro Ala Pro Arg Arg Arg Ala Ala Gin Pro 130 135 140
tec gac get tcg ccg gcc gcg cag gtg gat eta cgc acg etc ggc tac 480 Ser Asp Ala Ser Pro Ala Ala Gin Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr 145 150 155 160
agt cag cag cag caa gag aag ate aaa ccg aag gtg cgt tcg aca gtg 528 Ser Gin Gin Gin Gin Glu Lys lie Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val 165 170 175
gcg egg cac cac gag gca ctg gtg ggt cat ggg ttt aca cac gcg cac 576 Ala Arg His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His 180 185 190
ate gtt gcg etc age caa cac ccg gca gcg tta ggg acc gtt get gtc 624 lie Val Ala Leu Ser Gin His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val 195 200 205
9acg tat cag gac ata ate agg gcg ttg cca gag gcg aca cac gaa gac Thr Tyr Gin Asp lie lie Arg Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu 210 215 220
Asp
672
ate gtt ggc gtc ggc aaa cag tgg tec ggc gca cgc gcc ctg gag gcc
lie Val Gly Val Gly Lys Gin Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala
225 230 235 240
720
ttg etc acg gag gcg ggg gag ttg卿ggt ccg ccg tta cag ttg gac Leu Leu Thr Glu Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gin Leu 245 250 255
Asp
768
aca ggc caa ctt etc aag att gca aaa cgt ggc ggc gtg acc gca gtg Thr Gly Gin Leu Leu Lys lie Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala 260 265 270
Val
816
aag gca gtg cat gca tgg cgc aat gca ctg acg ggt gcc ccc ctg aac Lys Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu 275 280 285
Asn
864
ctg acc ccg gca cag gtg gtg gcc ate gcc age cac gat ggc ggc aat Leu Thr Pro Ala Gin Val Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly Gly 290 295 300
Asn
912
cag gcg ctg gag acg gtg cag egg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag gac
Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp
305 310 315 320
960
cat ggc ctg acc ccg gcg cag gtg gtg gcc ate gcc age cac gat ggc 1008 His Gly Leu Thr Pro Ala Gin Val Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly 325 330 335
ggc aag cag get ctg gag acg gtg cag egg ctg ttg ccg gtg ctg tgc 1056 Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 340 345 350
cag gac cat ggc ctg acc ccg gac cag gtc gtg gcc ate gcc age cac 1104 Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gin Val Val Ala lie Ala Ser His 355 360 365
gat ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg cag egg ctg ttg ccg gtg 1152 Asp Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val 370 375 380ctg tgc cag gac cat ggc ctg acc ccg gcg cag gcg gtg gcc ate gcc 1200 Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gin Ala Val Ala lie Ala 385 390 395 400
age aat ggc ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg caa egg ctg ttg 1248 Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu 405 410 415
ccg gtg ctg tgc cag gac cat ggc ctg acc ccg gac cag gtg gtg gcc 1296 Pro VaJ Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gin Val Val Ala 420 425 430
ate gcc age aat ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg cag egg ctg 1344 lie Ala Ser Asn Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu 435 440 445
ttg ccg gtg ctg tgc cag gac cat ggc ctg acc ccg gac cag gtc gtg 1392 Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gin Val Val 450 455 460
gcc att gcc age aat aac ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg cag 1440 Ala lie Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin 465 470 475 480
egg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag gac cat ggc ctg acc ccg gac cag 1488 Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gin 485 490 495
gtc gtg gcc ate gcc age cac gat ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg 1536 Val Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr 500 505 510
gtg cag egg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag gac cat ggc ctg acc ccg 1584 Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro 515 520 525
gac cag gtc gtg gcc ate gcc age cac gat ggc ggc aag cag gcg ctg 1632 Asp Gin Val Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gin Ala Leu 530 535 540
gag acg gtg cag egg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag gac cat ggc ctg 1680 Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly Leu 545 550 555 560acc ccg gac cag gtg gtg gcc ate gcc age aat ggc ggc aag cag gcg 1728 Thr Pro Asp Gin Val Val Ala lie Ala Ser Asn Gly Gly Lys Gin Ala 565 570 575
ctg gag acg gtg cag egg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag gac cat ggc 1776 Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly 580 585 590
ctg acc ctg gcg cag gtg gtg gcc ate gcc age aat att ggc ggc aag 1824 Leu Thr Leu Ala Gin Val Val Ala lie Ala Ser Asn lie Gly Gly Lys 595 600 605
cag gcg ctg gag acg gtg cag egg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag gac 1872 Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp 610 615 620
cat ggc ctg acc ccg gac cag gtc gtg gcc ate gcc age aat aac ggc 1920 His Gly Leu Thr Pro Asp Gin Val Val Ala lie Ala Ser Asn Asn Gly 625 630 635 640
ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg cag egg ctg ttg ccg gtg ctg tgc 1968 Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 645 650 655
cag gac cat ggc ctg acc ccg gac cag gtc gtg gcc ate gcc age cac 2016 Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gin Val Val Ala lie Ala Ser His 660 665 670
gat ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg cag egg ctg ttg ccg gtg 2064 Asp Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val 675 680 685
ctg tgc cag gac cat ggc ctg acc ccg gcg cag gtg gtg gcc ate gcc 2112 Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gin Val Val Ala lie Ala 690 695 700
age cat att ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg cag egg ctg ttg 2160 Ser His lie Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu 705 710 715 720
ccg gtg ctg tgc cag gac cat ggc ctg acc ctg gac cag gtg gtg gcc 2208 Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Leu Asp Gin Val Val Ala 725 730 735att gcc age aat gac ggc age aag cag gcg ctg gag acg gtg cag egg 2256 lie Ala Ser Asn Asp Gly Ser Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg 740 745 750
ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag gac cat ggc ctg acc ccg gac cag gtg 2304 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gin Val 755 760 765
gtg gcc ate gcc age cac gat ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg 2352 Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val 770 775 780
cag egg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag gac cat ggc ctg acc ccg aac 2400 Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Asn 785 790 795 800
caa gtg gtg gcc ate gcc age aat att ggc ggc aag cag gcg ctg gag 2448 Gin Val Val Ala lie Ala Ser Asn lie Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu 805 810 815
acg gtg cag egg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag gcc cat ggc ctg acc 24% Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Ala His Gly Leu Thr 820 825 830
ccg gac cag gtc gtg gcc ate gcc age cac gat ggc ggc aag cag gcg 2544 Pro Asp Gin Val Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gin Ala 835 840 845
ctg gag acg gtg cag egg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag aac cat ggc 2592 Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asn His Gly 850 855 860
ctg acc ccg gac cag gtc gtg gcc ate gcc age cac gat ggc ggc aag 2640 Leu Thr Pro Asp Gin Val Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly Gly Lys 865 870 875 880
cag gcg ctg gag acg gtg cag egg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag aac 2688 Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asn 885 890 895
cat ggc ctg acc ccg gac cag gtc gtg gcc ate gcc age aat ggc ggc 2736 His Gly Leu Thr Pro Asp Gin Val Val Ala lie Ala Ser Asn Gly Gly 900 905 910ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg caa egg ctg Ug ccg gtg ctg tgc 2784 Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 915 920 925
cag gac cat ggc ctg acc ccg gac cag gtc gtg gcc ate gcc age aat 2832 Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gin Val Val Ala lie Ala Ser Asn 930 935 940
ggc ggc ggc aag cag gcg ctg gag age att gtt gcc cag tta_ tct cgc 2880 Gly Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Ser lie Val Ala Gin Leu Ser Arg 945 950 955 960
cct gat ccg gcg ttg gcc gcg ttg acc aac gac cac etc gtc gcc ttg 2928 Pro Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu 965 970 975
gcc tgc etc ggc gga cgt cct gcc ctg gat gca gtg aaa aag gga ttg 2976 Ala Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu 980 985 990
ccg cac gcg ccg gaa ttg ate aga aga ate aat cgc cgt att ccc gaa Pro His Ala Pro Glu Leu lie Arg Arg lie Asn Arg Arg lie Pro Glu
3024
995
1000
1005
cgc acg tec cat cgc gtt gcc gac tac gcg caa gtg Arg Thr Ser His Arg Val Ala Asp Tyr Ala Gin 1010 1015
gtt cgc gtg Val Val Arg Val 1020
3069
ctg gag ttt ttc cag tgc cac tec cac cca gcg tac Leu Glu Phe Phe Gin Cys His Ser His Pro Ala 1025 1030
gca ttt gat Tyr Ala Phe Asp 1035
3114
gag gcc atg acg cag ttc ggg atg age agg aac ggg Glu Ala Met Thr Gin Phe Gly Met Ser Arg Asn 1040 1045
ttg gta cag Gly Leu Val Gin 1050
3159
etc ttt cgc aga gtg ggc gtc acc gaa etc gaa gcc Leu Phe Arg Arg Val Gly Val Thr Glu Leu Glu 1055 1060
cgc tgc gga Ala Arg Cys Gly 1065
3204
acg etc ccc cca gcc teg cag cgt tgg gac cgt ate Thr Leu Pro Pro Ala Ser Gin Arg Trp Asp Arg 1070 1075
etc cag gca lie Leu Gin Ala 1080
3249tea ggg atg aaa agg gcc aaa ccg tec cct act tea get caa acg 3294 Ser Gly Met Lys Arg Ala Lys Pro Ser Pro Thr Ser Ala Gin Thr 1085 1090 1095
ccg gat cag gcg tct ttg cat gca ttc gcc gat teg ctg gag cgt 3339 Pro Asp Gin Ala Ser Leu His Ala Phe Ala Asp Ser Leu Glu Arg 1100 1105 1110
gac ctt gat gcg ccc age cca atg cac gag gga gat cag acg egg 3384 Asp Leu Asp Ala Pro Ser Pro Met His Glu Gly Asp Gin Thr Arg 1115 1120 1125
gca age age cgt aaa egg tec cga teg gat cgt get gtc acc ggc 3429 Ala Ser Ser Arg Lys Arg Ser Arg Ser Asp Arg Ala Val Thr Gly 1130 1135 1140
ccc tec gca cag caa tct ttc gag gtg cgc gtt ccc gaa cag cgc 3474 Pro Ser Ala Gin Gin Ser Phe Glu Val Arg Val Pro Glu Gin Arg 1145 1150 1155
gat gcg ctg cat ttg ccc etc age tgg agg gta aaa cgc cag cgt 3519 Asp Ala Leu His Leu Pro Leu Ser Trp Arg Val Lys Arg Gin Arg 1160 1165 1170
acc agg ate ggg ggc ggc etc ccg gat cct ggt acg .ccc ate get 3564 Thr Arg lie Gly Gly Gly Leu Pro Asp Pro Gly Thr Pro lie Ala 1175 1180 1185
gcc gac ctg gca gcg tec age acc gtg atg tgg gaa caa gat gcg 3609 Ala Asp Leu Ala Ala Ser Ser Thr Val Met Trp Glu Gin Asp Ala 1190 1195 1200
gcc ccc ttc gca ggg gca gcg gat gat ttc ccg gca ttc aac gaa 3654 Ala Pro Phe Ala Gly Ala Ala Asp Asp Phe Pro Ala Phe Asn Glu 1205 1210 1215
gag gag etc gca tgg ttg atg gag eta ttg cct cag tea ggc tea 3699 Glu Glu Leu Ala Trp Leu Met Glu Leu Leu Pro Gin Ser Gly Ser 1220 1225 1230
gtc gga ggg acg ate tga 3717 Val Gly Gly Thr lie 1235
15SEQ ID NO. 2
<210〉 2 〈211〉 1238 〈212〉 PRT
<213〉 Xanthomonas oryzae pv. oryzae <400> 2
Met Asp Pro lie Arg Ser Arg Thr Pro Ser Pro Ala Arg Glu Leu Leu 15 10 15
Pro Gly Pro Gin Pro Asp Arg VaJ Gin Pro Thr Ala Asp Arg Gly Gly 20 25 30
Ala Pro Pro Ala Gly Gly Pro Leu Asp Gly Leu Pro Ala Arg Arg Thr 35 40 45
Met Ser Arg Thr Arg Leu Pro Ser Pro Pro Ala Pro Ser Pro Ala Phe 50 55 60
Ser Ala Gly Ser Phe Ser Asp Leu Leu Arg Gin Phe Asp Pro Ser Leu 65 70 75 80
Leu Asp Thr Ser Leu Leu Asp Ser Met Pro Ala Val Gly Thr Pro His 85 90 95
Thr Ala Ala Ala Pro Ala Glu Trp A印Glu Ala Gin Ser Gly Leu Arg 100 105 110
Ala Ala Asp Asp Pro Pro Pro Thr Val Arg Val Ala Val Thr Ala Ala 115 120 125
Arg Pro Pro Arg Ala Lys Pro Ala Pro Arg Arg Arg Ala Ala Gin Pro 130 135 140Ser Asp Ala Ser Pro Ala Ala Gin Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr 145 150 155 160
Ser Gin Gin Gin Gin Glu Lys lie Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val 165 170 175
Ala Arg His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His 180 185 190
lie Val Ala Leu Ser Gin His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val 195 200 205
Thr Tyr Gin Asp lie lie Arg Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Asp 210 215 220
lie Val Gly Val Gly Lys Gin Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala 225 230 235 240
Leu Leu Thr Glu Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gin Leu Asp 245 250 255
Thr Gly Gin Leu Leu Lys lie Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Val 260 265 270
Lys Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn 275 280 285
Uu Thr Pro Ala Gin Val Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly Gly Asn 290 295 300
Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp 305 310 315 320His Gly Leu Thr Pro Ala Gin Val Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly 325 330 335
Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 340 345 350
Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gin Val Val Ala lie Ala Ser His 355 360 365
Asp Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val 370 375 380
Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gin Ala Val Ala lie Ala 385 390 395 400
Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu 405 410 415
Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gin Val Val Ala 420 425 430
lie Ala Ser Asn Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu 435 440 445
Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gin Val Val 450 455 460
Ala lie Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin 465 470 475 480
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gin 485 490 495Val Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr 500 505 510
Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro 515 520 525
Asp Gin Val Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gin Ala Leu 530 535 540
Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly Leu 545 550 555 560
Thr Pro Asp Gin Val Val Ala lie Ala Ser Asn Gly Gly Lys Gin Ala 565 570 575
Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly 580 585 590
Leu Thr Leu Ala Gin Val Val Ala lie Ala Ser Asn lie Gly Gly Lys 595 600 605
Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp 610 615 620
His Gly Leu Thr Pro Asp Gin Val Val Ala lie Ala Ser Asn Asn Gly 625 630 635 640
Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 645 650 655
Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gin Val Val Ala lie Ala Ser His 660 665 670Asp Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val 675 680 685
Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gin Val Val Ala lie Ala 690 695 700
Ser His lie Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg Leu Leu 705 710 715 720
Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Leu Asp Gin Val Val Ala 725 730 735
lie Ala Ser Asn Asp Gly Ser Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val Gin Arg 740 745 750
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gin Val 755 760 765
Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Val 770 775 780
Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Asp His Gly Leu Thr Pro Asn 785 790 795 800
Gin Val Val Ala lie Ala Ser Asn lie Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu 805 810 815
Thr Val Gin Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gin Ala His Gly Leu Thr 820 825 830
Pro Asp Gin Val Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gin Ala 835 840 845<formula>formula see original document page 21</formula>Leu Glu Phe Phe Gin Cys His Ser His Pro Ala Tyr Ala Phe Asp 1025 1030 1035
Glu Ala Met Thr Gin Phe Gly Met Ser Arg Asn Gly Leu Val Gin 1040 1045 1050
Leu Phe Arg Arg Val Gly Val Thr Glu Leu Glu Ala Arg Cys Gly 1055 1060 1065
Thr Leu Pro Pro Ala Ser Gin Arg Trp Asp Arg lie Leu Gin Ala 1070 1075 1080
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Pro Asp Gin Ala Ser Leu His Ala Phe Ala Asp Ser Leu Glu Arg 1100 1105 1110
Asp Leu Asp Ala Pro Ser Pro Met His Glu Gly Asp Gin Thr Arg 1115 1120 1125
Ala Ser Ser Arg Lys Arg Ser Arg Ser Asp Arg Ala Val Thr Gly 1130 1135 1140
Pro Ser Ala Gin Gin Ser Phe Glu Val Arg Val Pro Glu Gin Arg 1145 1150 1155
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22Ala Asp Leu Ala Ala Ser Ser Thr Val Met Trp Glu Gin Asp Ala 1190 1195 1200
Ala Pro Phe Ala Gly Ala Ala Asp Asp Phe Pro Ala Phe Asn Glu 1205 1210 1215
Glu Glu Leu Ala Trp Leu Met Glu Leu Leu Pro Gin Ser Gly Ser 1220 1225 1230
Val Gly Gly Thr lie 123權利要求
1、一種激發水稻產生抗病反應的無毒基因avrxa5，其特征在于該基因序列為SEQ ID NO.1，序列長度為3717bp，基因上的酶切位點與avrBs3/PthA家族基因相同，102bp重復單元在基因內重復數為19.5。
2、 根據權利要求1所述的激發水稻產生抗病反應的無毒基因3Krxg5，其特 征是，該基因編碼1238個氨基酸，氨基酸的序列為SEQ ID NO. 2，由102bP編 碼的34個氨基酸重復單元在該蛋白中重復19. 5次。
3、 根據權利要求1所述的激發水稻產生抗病反應的無毒基因aw—ra5，其特 征是，該基因在含有;^5基因的水稻上可激發產生對白葉枯病的抗病性。
全文摘要
一種生物技術領域的激發水稻產生抗病反應的無毒基因avrxa5，該基因序列為SEQ ID NO.1，序列長度為3717bp，基因上的酶切位點與avrBs3/PthA家族基因相同，102bp重復單元在基因內重復數為19.5；無毒基因avrxa5編碼1238個氨基酸，氨基酸的序列為SEQ ID NO.2，由102bp編碼的34個氨基酸重復單元在該蛋白中重復19.5次。本發明獲得的avrxa5基因基因可作為水稻抗白葉枯病抗病育種的基因資源，將基因導入水稻白葉枯病菌PXO99^A菌株后，可使含xa5抗病基因的水稻產生抗病性反應，使白葉枯病菌難以有效侵染水稻。
文檔編號C12N15/31GK101451141SQ20081020721
公開日2009年6月10日 申請日期2008年12月18日 優先權日2008年12月18日
發明者李玉蓉, 趙文祥, 鄒麗芳, 鄒華松, 陳功友 申請人:上海交通大學