專利名稱：一種具有殺線蟲功能的食線蟲真菌及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有殺線蟲功能的食線蟲真菌及其制備方法和應用，屬微生物農藥技術領域。
背景技術：
植物寄生線蟲是一種世界范圍內普遍發生的植物病害，僅根結線蟲已知種類達70多種，為害3000多種植物，每年造成的損失巨大。據聯合國糧農組織統計，每年因線蟲造成損失全球高達1000億美元。我國線蟲主要危害煙草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋參等主要經濟作物，成為發展這些作物的重要限制因子。長期以來，線蟲防治主要依賴于化學防治。盡管化學殺線蟲劑在線蟲防治中發揮了重要作用，但隨著科學技術的進步，發現許多化學殺線蟲劑均有副作用。造成環境污染，危害人體健康，相繼有不少被禁用或即將禁用。特別是植物寄生線蟲發生于作物根部，由于土壤環境的特殊性，必須大劑量施用才能保證其防效。而大劑量化學農藥對地下水污染非常嚴重。因此，研究開發高效低毒低殘留殺線蟲劑已經是農業可持續發展中的重要課題。
食線蟲菌物是一類線蟲天敵，目前市場上成功上市的線蟲生防制劑均來源這類菌物。其中，隔指孢菌是重要的類群。
發明內容
本發明的目的是通過對一株產生胞外蛋白酶分解線蟲體壁的獅子山隔指孢真菌的研究，開發生物殺線蟲劑。
獅子山隔指孢系本發明人在開展的食線蟲菌物研究中，從大量樣品中分離發現的一株對線蟲具有很好毒殺作用的隔指孢屬新種，命名為獅子山隔指孢(Dactylellashizishanna)YMF1.00022，YMF1.00022菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關村；保藏日期2005年1月27日；保藏登記入冊的編號CGMCC No.1311。
本發明獅子山隔指孢(Dactylella shizishanna)YMF1.00022菌株形態特征為菌落在CMA培養基上近無色，氣生菌絲稀疏，菌絲透明，分隔，分枝，通常寬2.5-3.7μm；分生孢子梗從基質菌絲上長出，單個直立，偶有分枝，高35-200μm，基部寬1.5-2.5μm，向頂部漸細，頂端寬0.5-1.0μm，單個分生孢子著生于分生孢子梗末端；分生孢子透明，棒狀，遠端鈍圓，下端漸細，大小為22.5-73.8μm，有厚垣孢子，捕食器官為三維菌網。
本發明是這樣實現的擴大培養獅子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022，提取殺線蟲有效成分，進行殺線蟲藥效試驗，確定其對線蟲的作用。
獅子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022培養方法(以下為重量百分比)1、試管種培養培養基配方為1-2％葡萄糖，10-20％馬鈴薯汁(煮沸20分鐘后過濾所得)，1.8-2％瓊脂；pH自然。將菌絲體接種到培養基上，25-28℃下培養10-14天，獲得試管種；2、液體擴大培養液體培養基配方為0.1-0.2％明膠；0.6-0.8％胰蛋白胨；0.1-0.2％酵母浸出粉；0.05％硫酸銨；0.001-0.002％硫酸亞鐵；0.05-0.1％硫酸鎂；1.129％磷酸氫二鈉；1.238％磷酸二氫鈉pH6.5，余下為水。將試管種接種到250ml三角瓶液體培養基中，每瓶裝60ml，于22-28℃下搖床培養培養時間6-9天，轉速為200-230rpm。
3、提取殺線蟲活性成份將發酵培養物用干凈紗布濾去菌絲體，取上清液，按1∶0.56的比例緩慢加入硫酸銨，于4℃靜置2小時，然后8500rpm離心15分鐘，棄上清。用10mM磷酸緩沖液(68.5ml的10mM磷酸二氫鈉加31.5ml的10mM磷酸氫二鈉，pH為6.5)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于10-20倍的10mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時，即得殺線蟲藥液。將藥液保存于4℃冰箱中待用。
殺線蟲活性試驗1、制備試驗用藥劑按前述液體擴大培養方法培養獅子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022菌株，按前述提取殺線蟲活性成份的方法制備試驗用藥劑。
2、制備對照用藥劑對照1按前述制備試驗用藥劑方法制備對照用藥劑，但培養基中不接入獅子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022菌株。
對照2為了證明殺線蟲有效成份是毒蛋白或者是酶，將制備供試藥劑煮沸滅活后作為對照。
對照3以清水作為對照。
3、制備試驗用線蟲1)制備Panagrellus redivivus線蟲將P.redivivus線蟲接種于燕麥片培養基上，于28℃下培養6天，凍于4℃冰箱備用。將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內，加5ml無菌水洗滌，瞬時離心，棄上清，重復5次得到潔凈供試線蟲。用無菌水將線蟲稀釋為含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
2)制備松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)在100ml三角瓶中放入15g經水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高壓滅菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培養4至7天。待菌絲鋪滿三角瓶后，接種經0.25％次氯酸鈉表面消毒的松材線蟲，28℃培養15至20天。用無菌水將線蟲洗下，制成含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
3、試驗方法(1)藥效試驗方法取試驗用藥劑200μl于1.5ml離心管中，分別加入Panagrellus redivivus線蟲和松材線蟲60條，離心管平放，置于25℃下，分別于12小時、24小時、36小時檢查計算線蟲的死亡率。并在光學顯微鏡下觀察，觀察線蟲體壁變化情況鑒定死亡的方法為在處理離心管中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分鐘后觀察，死蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動。
分別用3種對照藥劑，每處理重復三次。
4、試驗結果表1 獅子山隔指孢YMF1.00022 對Panagrellus redivivus線蟲殺蟲效果
表2 獅子山隔指孢YMF1.00022 對松材線蟲殺蟲效果
結果表明，從獅子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022菌株液體發酵產物中提取的試驗用藥劑對Panagrellus redivivus線蟲具較好的毒殺作用，線蟲24小時的死亡率達98％，體壁大都溶解(圖1)。從處理線蟲的變化來看，經歷了從部份體壁溶解到蟲體全部溶解的過程，說明活性成份主要為分解線蟲的酶類。而將同批提取的試驗用藥劑經過煮沸，導致蛋白質變性后，其殺線蟲活性非常小，且線蟲體壁不出現溶解現象(圖2)，這也證明了獅子山隔指孢對線蟲的活性成份主要為酶類。
結果同時表明，獅子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022菌株對松材線蟲有一定的毒殺作用，線蟲36小時的死亡率達80％，蟲體僵直，說明本發明菌株對松材線蟲的毒殺作用明顯低于Panagrellus redivivus線蟲，作用時間延緩。
本發明獅子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.0，0022菌株對線蟲的毒力顯著高于目前其他所發現的同類微生物。同時在本發明培養條件下生長很快，具備了很好的應用開發前景。
圖1顯示處理線蟲分解情況。
圖2顯示對照頭部保持完好的對照線蟲
具體實施例方式以下是本發明的實施例，但本發明的內容并不局限于此。
實施例一將獅子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022菌絲體接種到平板瓊脂培養基上，培養基配方為PDA培養基配方。將獅子山隔指孢Dactylella shizishanna，YMF1.00022菌絲體接種到培養基上，28℃下培養10-14天，獲得平板種。
將平板種接種到250ml三角瓶液體培養基中(每瓶裝60ml)，液體培養基配方為0.15％明膠；0.8％胰蛋白胨；0.1％酵母浸出粉；0.05％硫酸銨；0.001％硫酸亞鐵；0.05％硫酸鎂；1.129％磷酸氫二鈉；1.238％磷酸二氫鈉 pH6.5，余下為水。于27℃下搖床培養培養時間7天，轉速為220rpm。
將發酵培養物用干凈紗布濾去菌絲體，取上清液，按1∶0.56的比例緩慢加入硫酸銨，于4℃靜置2小時，然后8500rpm離心15分鐘，棄上清。用10mM磷酸緩沖液(68.5ml的10mM磷酸二氫鈉加31.5ml的10mM磷酸氫二鈉，pH為6.5)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于10-20倍的10mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時，即得殺線蟲藥液。將藥液保存于4℃冰箱中待用。
實施例二基本同實施例一，不同之處是液體培養基配方，其配方為0.1％明膠；0.6％胰蛋白胨；0.15％酵母浸出粉。
實施例三基本同實施例一，不同之處是液體培養基配方，其配方為0.2％明膠；0.7％胰蛋白胨；0.2％酵母浸出粉。
權利要求
1.一種具有殺線蟲功能的食線蟲真菌，由生產菌株經試管種培養、液體發酵培養及提取殺線蟲有效成分工序制備，其特征在于生產菌株為獅子山隔指孢(Dactylella shizishanna)YMF1.00022，保藏日期2005年1月27日，保藏號CGMCCNo.1311。
2.權利要求1所述的具有殺線蟲功能的食線蟲真菌的制備方法，包括試管種培養、液體發酵培養及提取殺線蟲有效成分工序，其特征在于2.1液體發酵培養基配方0.1-0.2％明膠；0.6-0.8％胰蛋白胨；0.1-0.2％酵母浸出粉；0.05％硫酸銨；0.001％硫酸亞鐵；0.05％硫酸鎂；1.129％磷酸氫二鈉；1.238％磷酸二氫鈉pH6.5，余下為水；2.2從液體發酵產物中提取殺線蟲有效成分的方法是將發酵培養物用干凈紗布濾去菌絲體，取上清液，按1∶0.56的比例緩慢加入硫酸銨，于4℃靜置2小時，然后8500rpm離心15分鐘，棄上清。用10mM磷酸緩沖液(68.5ml的10mM磷酸二氫鈉加31.5ml的10mM磷酸氫二鈉，pH為6.5)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于10-20倍的10mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時。
3.權利要求1所述的具有殺線蟲功能的食線蟲真菌，其特征在于該桿菌對Panagrellus redivivus線蟲和松材線蟲具有毒殺作用，可以應用于植物寄生線蟲生防。
全文摘要
本發明涉及一種具有殺線蟲功能的食線蟲真菌及其制備方法和應用，屬微生物農藥技術領域。本發明菌株通過液體發酵后，從代謝產物中提取殺線蟲有效成分，制備為食線蟲真菌。生產菌株為獅子山隔指孢(Dactylella shizishanna)YMF1.00022，其液體發酵培養基配方為0.1－0.2％明膠；0.6－0.8％胰蛋白胨；0.1－0.2％酵母浸出粉；0.05％硫酸銨；0.001％硫酸亞鐵；0.05％硫酸鎂；1.129％磷酸氫二鈉；1.238％磷酸二氫鈉pH6.5，余下為水。提取殺線蟲有效成分的方法是，將發酵培養物取上清液，按1∶0.56的比例緩慢加入硫酸銨，于4℃靜置2小時，然后8500rpm離心15分鐘，棄上清。用10mM磷酸緩沖液重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋于10－20倍的10mM磷酸緩沖液中透析3－4次，每次3小時。本發明產品對線蟲具有毒力高的突出優點，具有較好的潛在應用前景。
文檔編號A01N63/04GK1673348SQ200510010689
公開日2005年9月28日 申請日期2005年3月16日 優先權日2005年3月16日
發明者張克勤, 王瑞賓, 周薇 申請人:云南大學