專利名稱：一種姬松茸富鋅液體培養的方法
技術領域：
本發明涉及生物發酵領域，具體的說是一種通過液體深層發酵技術進行姬松茸富集微量元素鋅的液體培養方法。
背景技術：
姬松茸(Agaricus blazei murill)原產于巴西，美國等地，故名巴西蘑菇，又名小松菇，是一種食藥兼用的真菌。近年來國內外實驗研究發現姬松茸子實體中含有抗腫瘤多糖、凝集素(lectin)、甾醇、核酸等生理活性成分，引起了極大關注，同時發現姬松茸在降血脂、降血壓、治療糖尿病及維護肝功能等方面具有顯著的醫療保健作用，是一種極具開發價值的珍貴食藥用真菌。
近十年來，日本對姬松茸進行了較為系統的研究，主要偏重于從姬松茸子實體中提取活性成分以及其實驗室水平上藥理作用的研究，目前發現姬松茸子實體中的抗腫瘤成分主要有多糖、甾醇、凝集素、不飽和脂肪酸及核酸蛋白復合物等。姬松茸抗癌效果顯著，據日本東京大學醫學部、國立癌癥研究中心報道，姬松茸的抗癌作用明顯優于其它11種有抗癌作用的大型真菌，位居抗癌真菌首位，而且具有用量少、抗癌作用強等特點。美國Health-plus’sand Vesta’s公司已生產用子實體提取物做成的膠囊，用于治療AIDS病。并報道在美國和墨西哥醫院用于治療癌癥病人，包括IV期病人。
隨著姬松茸液體培養技術的逐步成熟，研究表明液體發酵獲得的菌絲體、發酵液的提取物同固體栽培的子實體及子實體提取物有相同活性(T.mizuno，1995)。
相關的姬松茸液體培養方面的專利有龔建華等人建立的一種液體培養姬松茸的方法(申請號00124928.2)；樊美珍等人建立了工業液體發酵生產姬松茸的工藝方法(專利號ZL00135444.2)；李保健等人發明了大規模液體深層生產姬松茸的生產工藝(專利號ZL01129715.8)。
微量元素具有重要的生物學作用，在維持機體健康方面具有重大實用價值，鋅是生命必需的微量元素之一，是人體許多活化酸的催化因子，參與體內300余種酸和功能蛋白的組成，具有廣泛的生理生化功能。鋅對提高智力，提高婦女優生優育率，避免習慣性流產、死胎、早產和先天畸形，有降血壓、膽固醇、甘油三酯的作用，還有治療高血壓、冠心病、腦血栓后遺癥、糖尿病等保健功能。據資料顯示，我國約有60％的兒童每天鋅的攝入量為標準量的50％，影響了兒童的正常發育。對老年人的鋅營養狀況研究表明，鋅攝入不足，易致免疫功能的減退，易患腫瘤和感染性疾病。而以無機鹽形式補鋅，其缺點是難以吸收，且一般游離態金屬均具有一定的毒性。
目前鋅強化食品的鋅源絕大部分為無機鋅，不易為人體吸收；有機鋅是一種新型的鋅源，無機鋅有機化之后，形成的金屬一有機復合物對人體可產生各種特殊的生理功能和保健功能。研制開發高生物學利用率的補鋅產品乃當務之急。
利用姬松茸在生長過程中能富集金屬元素的特性，將無機鋅生物轉化為有機鋅，可以大大提高機體對鋅的生物利用率。章克昌、鄒祥等人進行這方面的研究，使姬松茸富鋅率達到8.41％。(無錫輕功大學學報，2003，22(2)48-52)。
發明內容
本發明的目的在于尋求一種姬松茸富鋅液體培養的方法，盡可能的提高姬松茸的富鋅率，使更多的無機鋅轉化為有機鋅，從而更有利于發揮鋅的免疫功能和姬松茸的抗腫瘤及其它疾病病功能。
按照本發明所提供的設計方案，姬松茸富鋅液體培養的方法包括下述步驟a、斜面菌種培養取分離純化的姬松茸菌種接種于斜面培養基中，放入培養箱，25℃培養，待菌絲長滿斜面后，轉入下一步培養；b、液體種子培養將培養好的斜面菌種接入液體種子培養基中，培養條件為24～28℃，搖床轉速120～150轉/分鐘，培養6～10天；c、富鋅發酵培養將培養好的液體種子按5～15％體積比的接種量轉接入裝有富鋅發酵培養基的發酵罐中，24～28℃培養，發酵罐壓力0.05Mpa，攪拌速率90～130轉每分鐘，通風量1∶0.3～0.8v/v/m，培養3～5天，在富鋅發酵培養過程中進行pH控制發酵，即起始pH為5.4～5.8，當發酵液pH下降到4.8～5.0時，補加堿性物質，控制發酵pH維持在4.8～5.1范圍內24～48小時，得到富含有機鋅的姬松茸發酵液。
所述斜面培養基是普通土豆培養基。將培養好的斜面菌種切割成黃豆大小的小塊接種于液體種子培養基中，種子培養基為(單位為克/升)玉米粉10～30，蔗糖15～30，麩皮10～25，磷酸二氫鉀0.8～2，硫酸鎂0.5～1.5，維生素B10.08～0.1，起始pH為自然pH。
富鋅發酵培養的發酵培養基為(單位為克/升)玉米粉10～30，蔗糖5～20，麩皮10～25，磷酸二氫鉀1.5～3，硫酸鎂1.0～2.5，維生素B10.08～0.1，棕櫚酸1.8～2.5，硫酸鋅0.15～0.5。
富鋅發酵培養的富鋅發酵培養過程進行pH控制發酵，即起始pH為5.4～5.8，當發酵液pH下降到4.8～5.0時，補加堿性物質，控制發酵pH維持在4.8～5.1范圍內24～48小時。
所述的堿性物質通常采用低濃度氫氧化鈉，添加量根據實際情況確定，目的是將發酵液的pH維持在4.8～5.1。
本發明所述的姬松茸菌種購自華中農業大學菌種中心。
本發明步驟2所述的液體種子培養，其培養基放在搖瓶中，搖瓶放于搖床上，液體種子培養基的體積與搖瓶體積之比為1∶5。
本發明步驟3所述的富鋅發酵培養，發酵罐培養的發酵液體積與發酵罐體積之比為6～7∶10。
本發明步驟3所述的通風量1∶0.3～0.8v/v/m，是指1個體積的發酵液每分鐘通0.3～0.8體積的空氣。
本發明步驟3所述的富鋅發酵培養結束的標準為發酵液糖濃度下降到小于等于5克/升，發酵液pH下降到4.6。
本發明的優點在于在富鋅發酵過程中通過pH控制使姬松茸的富鋅率大大提高，富鋅率達到11.7～12.2％，從而使更多無機鋅轉變為有機鋅；本發明更有利于發揮鋅的免疫功能和姬松茸的抗腫瘤及其它疾病病功能，姬松茸富鋅后，它的抗腫瘤活性得到進一步的提高；本發明為今后姬松茸富鋅的工業化生產打下了堅實的基礎。
具體實施例方式
在下面所述的所有具體實施方式
中糖的測定采用DNS法，該方法在《發酵工業分析》(天津輕工業學院、無錫輕工大學、大連輕工業學院、華南理工大學編著；1980年第1版，2002年第10次印刷)以及其它眾多相關的教科書和著作中均有詳細的表述，在這里不再詳述。鋅濃度的測定采用的方法為雙硫腙分光光度法GB/T 500914-1996，中華人民共和國國家標準；鋅有機化程度分析所采用的方法為靜置浸出法(微生物學報，1997，37(1)40-56)。所述實施例中的發酵罐的體積為30升，pH可自動控制。氫氧化鈉溶液的濃度為5％(質量百分比)，單獨滅菌后供發酵過程流加使用。
實施例1種子培養基的體積為100毫升，裝入500毫升的三角瓶中，共9瓶。將斜面長好的菌種接入種子培養基中。種子培養基為(單位為克/升)玉米粉10，蔗糖15，麩皮10，磷酸二氫鉀0.8，硫酸鎂0.5，維生素B10.08，起始pH為自然pH。培養條件為24℃，搖床轉速120轉每分鐘，培養10天。將培養好的種子接入發酵罐中，接種量為900毫升，發酵液總體積18升。發酵培養基為玉米粉10，蔗糖5，麩皮10，磷酸二氫鉀1.5，硫酸鎂1.0，維生素B10.08，棕櫚酸1.8，硫酸鋅0.15。24℃培養，發酵罐壓力0.05Mpa，攪拌速率90轉每分鐘，通風量1∶0.8v/v/m。發酵起始pH5.4，當發酵液pH降到5.0后，發酵罐自動控制流加氫氧化鈉溶液，維持pH在4.8～5.1范圍內24小時，培養3天。姬松茸的富鋅率為11.7％。
實施例2種子培養基的體積為100毫升，裝入500毫升的三角瓶中，共9瓶。將斜面長好的菌種接入種子培養基中。種子培養基為(單位為克/升)玉米粉30，蔗糖30，麩皮25，磷酸二氫鉀2，硫酸鎂1.5，維生素B10.1，起始pH為自然pH。培養條件為24℃，搖床轉速150轉每分鐘，培養6天。將培養好的種子接入發酵罐中，接種量為900毫升，發酵液總體積18升。發酵培養基為玉米粉30，蔗糖20，麩皮25，磷酸二氫3，硫酸鎂2.5，維生素B10.1，棕櫚酸2.5，硫酸鋅0.5。24℃培養，發酵罐壓力0.05Mpa，攪拌速率90轉每分鐘，通風量1∶0.8v/v/m。發酵起始pH5.8，當發酵液pH降到4.8后，發酵罐自動控制流加氫氧化鈉溶液，維持pH在4.8～5.1范圍內48小時，培養5天。姬松茸的富鋅率為11.8％。
實施例3
種子培養基的體積為100毫升，裝入500毫升的三角瓶中，共21瓶。將斜面長好的菌種接入種子培養基中。種子培養基為(單位為克/升)玉米粉20，蔗糖20，麩皮15，磷酸二氫鉀1.2，硫酸鎂0.75，維生素B10.09，起始pH為自然pH。培養條件為28℃，搖床轉速140轉每分鐘，培養7天。將培養好的種子接入發酵罐中，接種量為2.1升，發酵液總體積21升。發酵培養基為玉米粉20，蔗糖10，麩皮15，磷酸二氫鉀2.0，硫酸鎂2.0，維生素B10.09，棕櫚酸2.0，硫酸鋅0.3。24～28℃培養，發酵罐壓力0.05～0.08Mpa，攪拌速率130轉每分鐘，通風量1∶0.4v/v/m。發酵起始pH5.6，當發酵液pH降到4.9后，發酵罐自動控制流加氫氧化鈉溶液，維持pH在4.8～5.1范圍內36小時，培養4天。姬松茸的富鋅率為11.8％。
實施例4種子培養基的體積為100毫升，裝入500毫升的三角瓶中，共24瓶。將斜面長好的菌種接入種子培養基中。種子培養基為(單位為克/升)玉米粉15，蔗糖18，麩皮22，磷酸二氫鉀1.8，硫酸鎂1.2，維生素B10.08，起始pH為自然pH。培養條件為27℃，搖床轉速1425轉每分鐘，培養9天。將培養好的種子接入發酵罐中，接種量為2.4升，發酵液總體積20升。發酵培養基為玉米粉15，蔗糖15，麩皮18，磷酸二氫鉀2.25，硫酸鎂1.25，維生素B10.08，棕櫚酸2.25，硫酸鋅0.2。27℃培養，發酵罐壓力0.05Mpa，攪拌速率120轉每分鐘，通風量1∶0.5v/v/m。發酵起始pH5.5，當發酵液pH降到4.8后，發酵罐自動控制流加氫氧化鈉溶液，維持pH在4.8～5.1范圍內40小時，培養4天。姬松茸的富鋅率為12.0％。
實施例5種子培養基的體積為100毫升，裝入500毫升的三角瓶中，共10瓶。將斜面長好的菌種接入種子培養基中。種子培養基為(單位為克/升)玉米粉25，蔗糖25，麩皮10，磷酸二氫鉀1.0，硫酸鎂1.0，維生素B11.0，起始pH為自然pH。培養條件為25℃，搖床轉速150轉每分鐘，培養8天。將培養好的種子接入發酵罐中，接種量為1.0升，發酵液總體積20升。發酵培養基為玉米粉25，蔗糖10，麩皮10，磷酸二氫鉀2.5，硫酸鎂1.0，維生素B11.0，棕櫚酸2.0，硫酸鋅0.3。25℃培養，發酵罐壓力0.05Mpa，攪拌速率115轉每分鐘，通風量1∶0.5v/v/m。發酵起始pH5.6，當發酵液pH降到5.0后，發酵罐自動控制流加氫氧化鈉溶液，維持pH在4.8～5.1范圍內32小時，培養4天。姬松茸的富鋅率為12.2％。
實施例6種子培養基的體積為100毫升，裝入500毫升的三角瓶中，共32瓶。發酵罐的接種量為3.15升，發酵液體積21升。當發酵液pH降到4.8后，發酵罐自動控制流加氫氧化鈉溶液，維持pH在4.8～5.1范圍內24小時，培養3天。其余條件同實施例3。姬松茸的富鋅率為11.9％。
實施例7種子培養基的體積為100毫升，裝入500毫升的三角瓶中，共30瓶。將斜面長好的菌種接入種子培養基中。種子培養基同實施例1。培養條件為26℃，搖床轉速150轉每分鐘，培養7天。將培養好的種子接入發酵罐中，接種量為3.0升，發酵液總體積20升。發酵培養基同實施例2。26℃培養，發酵罐壓力0.05Mpa，攪拌速率130轉每分鐘，通風量1∶0.3v/v/m。發酵起始pH5.7，當發酵液pH降到4.8后，發酵罐自動控制流加氫氧化鈉溶液，維持pH在4.8～5.1范圍內44小時，培養5天。姬松茸的富鋅率為11.9％。
實施例8種子培養基的體積為100毫升，裝入500毫升的三角瓶中，共18瓶。將斜面長好的菌種接入種子培養基中。種子培養基為同實施例2。培養條件為27℃，搖床轉速135轉每分鐘，培養6天。將培養好的種子接入發酵罐中，接種量為1.8升，發酵液總體積18升。發酵培養基同實施例1。27℃培養，發酵罐壓力0.05Mpa，攪拌速率110轉每分鐘，通風量1∶0.7v/v/m。發酵起始pH5.8，當發酵液pH降到5.0后，發酵罐自動控制流加氫氧化鈉溶液，維持pH在4.8～5.1范圍內28小時，培養3天。姬松茸的富鋅率為11.8％。
實施例9種子培養基的體積為100毫升，裝入500毫升的三角瓶中，共27瓶。將斜面長好的菌種接入種子培養基中。種子培養基為和培養條件同實施例5。將培養好的種子接入發酵罐中，接種量為2.7升，發酵液總體積18升。發酵培養基為硫酸鋅0.4，其余成份同同實施例5。發酵條件同實施例5。姬松茸的富鋅率為12.1％。
實施例10種子培養基的體積為100毫升，裝入500毫升的三角瓶中，共20瓶。將斜面長好的菌種接入種子培養基中。種子培養基為和培養條件同實施例3。將培養好的種子接入發酵罐中，接種量為2.0升，發酵液總體積20升。發酵培養基同實施例4。26℃培養，發酵罐壓力0.05Mpa，攪拌速率125轉每分鐘，通風量1∶0.4v/v/m。發酵起始pH5.7，當發酵液pH降到4.9后，發酵罐自動控制流加氫氧化鈉溶液，維持pH在4.8～5.1范圍內36小時，培養4天。姬松茸的富鋅率為12.1％。
權利要求
1.一種姬松茸富鋅液體培養的方法，其特征在于，a、斜面菌種培養取分離純化的姬松茸菌種接種于斜面培養基中，放入培養箱，25℃培養，待菌絲長滿斜面后，轉入下一步培養；b、液體種子培養將培養好的斜面菌種接入液體種子培養基中，培養條件為24～28℃，搖床轉速120～150轉/分鐘，培養6～10天；c、富鋅發酵培養將培養好的液體種子按5～15％體積比的接種量轉接入裝有富鋅發酵培養基的發酵罐中，24～28℃培養，攪拌速率90～130轉每分鐘，通風量1∶0.3～0.8v/v/m，培養3～5天，在富鋅發酵培養過程中進行pH控制發酵，即起始pH為5.4～5.8，當發酵液pH下降到4.8～5.0時，補加堿性物質，控制發酵pH維持在4.8～5.1范圍內24～48小時，得到富含有機鋅的姬松茸發酵液。
2.根據權利要求1所述姬松茸富鋅液體培養的方法，其特征在于，液體種子培養基為玉米粉10～30，蔗糖15～30，麩皮10～25，磷酸二氫鉀0.8～2，硫酸鎂0.5～1.5，維生素B10.08～0.1，單位為克/升，起始pH為自然pH；培養條件為24～28℃，搖床轉速120～150轉/分鐘，培養6～10天。
3.根據權利要求1所述姬松茸富鋅液體培養的方法，其特征在于，富鋅發酵培養基為玉米粉10～30，蔗糖5～20，麩皮10～25，磷酸二氫鉀1.5～3，硫酸鎂1.0～2.5，維生素B10.08～0.1，棕櫚酸1.8～2.5，硫酸鋅0.15～0.5，單位為克/升。
4.根據權利要求1所述姬松茸富鋅液體培養的方法，其特征在于，斜面培養基是土豆培養基。
5.根據權利要求1所述姬松茸富鋅液體培養的方法，其特征在于，液體種子培養基體積與所用的放置于搖床上的搖瓶體積之比為1∶5。
6.根據權利要求1所述姬松茸富鋅液體培養的方法，其特征在于，富鋅發酵培養的發酵液體積與發酵罐體積之比為6～7∶10。
全文摘要
本發明涉及生物發酵領域，具體的說是一種通過液體深層發酵技術進行姬松茸富集微量元素鋅的液體培養方法。本發明主要通過斜面菌種培養、液體種子培養、富鋅發酵培養等三個步驟進行姬松茸富集微量元素鋅的液體培養，在富鋅發酵培養過程進行pH控制發酵，即起始pH為5.4～5.8，在發酵過程中補加堿性物質，控制發酵pH維持在4.8～5.1范圍內24～48小時。本發明的優點在于通過對發酵過程進行pH控制，使姬松茸的富鋅率大大提高，富鋅率達到11.7～12.2％，從而使更多無機鋅轉變為有機鋅；本發明更有利于發揮鋅的免疫功能和姬松茸的抗腫瘤及其它疾病病功能，姬松茸富鋅后，它的抗腫瘤活性得到進一步的提高；本發明為今后姬松茸富鋅的工業化生產打下了堅實的基礎。
文檔編號A01H4/00GK1685810SQ20051003883
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月31日 優先權日2005年3月31日
發明者章克昌, 王玉紅, 劉坤, 徐柔 申請人:章克昌