專利名稱：液體菌根接種物的制作方法
技術領域：
本技術方案涉及農業科學，特別是有機生物肥料的產生，并具體地，涉及獲得一種液體菌根接種物，其可直接地并通過灌溉系統而施用于土壤和植物。
現有技術多種功能已經歸因于菌根聯合體(mycorrhizal association)，這些功能包括通過顯著增加該系統來改善根系的吸收表面，增加土壤毒素的耐受性，增加某些營養元素(N、P、Ca、Mg、Mn、Cu、Zn、B等)的溶解，增加對不利條件如干旱、鹽度、吸收選擇性的抗性，通過形成穩定的團聚體而改良土壤的物理特性，以及針對根病原體的一定的保護作用。該聯合體應用于農業意味著強的環境影響，因為其有助于存在于菌根真菌-植物聯合體的菌根際和根際中的不同微生物群之間的更好的平衡以及通常有助于針對生物和非生物脅迫影響的更高的保護。
在植物中獲得和隨后應用基于叢枝狀菌根真菌(arbuscularmycorrhizal fungi)的接種物具有特殊的特征，因為它們不能單獨生長于純性培養基中，而是在寄主植物根部完成它們的生活周期，因此一旦結束植物的生活周期(為了生產這些接種物，使用3至4個月大的短周期植物)，就提取定殖有所述真菌的根系以及在聯合(association)過程中產生的真菌繁殖體(基物外生的生菌絲體和孢子)以及它們所生長的底質，將所有的這些組分在固體基質上制成菌根接種物(Fernandez，F.第3章.Bases Científico Técnicas parael manejo de los sistemas micorrizados eficientemente.InRivera，Fernández，eds.INCA，Havana.2003)。
目前，在這種類型接種物的生產中，使用下列底質(Feldman，F.和Idozak，E.Inoculum production of Vesicular-arbuscularMycorrhizal Fungi for use in tropical nurseries.InMethodsin Microbiology.第24卷ISBN 0-12-521524-X.Eds.AcademicPress Limited.1992；Fernandez，F等人，Author’s Certificate22641.OCPI.1999)-土壤-土壤+有機質-有機質-沙-粘土-粘土+沙-粘土+有機質-沙+有機質+土壤-液體流式小室中的營養液-蛭石-珍珠巖-苔蘚泥炭-膨脹的蒙脫土-所有這些底質的組合。
將從前面提及的底質培養的菌根產品直接施用于包衣的種子，施用量為直接播入田地的種子的總重量的10％(Fernandez，F等人，Author’s Certificate 22641.OCPI.1999)或者以1至2T/h的速率直接施用接種物。在進行苗床和苗圃培養的情況下，施用比率應當不超過1kg/m2和10g/種子，常常將產品分別置于要播種的種子下面(Sieverding，E.Vesicular.Arbuscular Mycorrhiza in TropicalAgrosystem.Deutsche Gesellsschaft fur tecniischeZusammenarbeit(GTZ)GMBH，Federal Republic of Germany.1991.371p)。
不能通過灌溉系統或加肥灌溉(fertigation)系統來施用這些接種物主要是由于缺乏滿足合適特性的液體接種物，讓其能耐受灌溉管中產生的流體靜壓的急劇變化。
基于將固體、半固體底質施加至絮凝劑并且基于在液體培養基中較小規模地使用這些微生物，已經開發了叢枝狀菌根接種物的生產方法。
對于固體培養基，有已經使用各種不同的增殖底質的專利的一些實例，例如US4945059、JP7123979、JP4187081、DE10161443和DE10221762。這些接種物是不適合的，因為它們通常使用大量的底質，孢子萌發受到長的休眠期的影響，該產品中的繁殖體濃度是天然的，即，其不能以期望的大小進行濃縮。
對于半固體接種物的情形，已經公開了下列專利EP0726305、EP0596217、EP0072213、US5120344、EP0495108、EP0475433、US5436218、US3437625、US3557562、EP0023347、US2856380、US3857991和GB2381264。這些產品是基于在絮凝劑介質中使用底質如凝膠、共聚物、粘土。和前面的情況一樣，在農業應用中使用了大量的底質，這不能解決菌根真菌孢子的休眠期問題。
與專利一起報道的液體接種物主要與外生菌根相關(CN1420167，US2004208852)，并且我們僅發現了一種由日本人報道的液體介質(JP4141023)，其基于使用穩定劑(檸檬酸或其鹽)來保護孢子。
一般而言，所熟知的菌根產品不具有統一的孢子萌發，并且這些真菌物種的休眠機制也不能改善，因為這些接種物所處于的底質不能將應激狀態(stressing situation)賦予繁殖體，所述應激狀態加速了一旦在田間條件下接種時孢子的萌發過程。
另一方面，尚未有報道迄今生產的具有菌根繁殖體的天然限制的菌根接種物，因為獲取方法不能使大量特定繁殖體濃縮。目前熟知的具有較高濃度的菌根產品具有這樣的孢子∶菌絲體關系，即50個孢子/g培養基∶65mg菌絲體/g培養基(Fernández，F.第3章.BasesCientífico Técnicas parael manejo de los sistemas micorrizadoseficientemente.InRivera，Fernández，eds.INCA，Havana.2003)。
這些真菌的特殊糖蛋白(稱為Glomaline)加速了土壤中穩定微團聚體的形成過程，改善了它們的物理結構，增加了氧水平，并使得生物體能更好地定殖(colonize)。由于Glomaline在共生過程中只以天然方式分泌，或者在某種分泌介質的作用下，其看來在熟知的菌根接種物中不分泌至固體載體上，并且其在土壤中的水平取決于與生物體的共生狀態，并且不能超過這種共生所允許的水平。
發明描述本發明的主要目標在于高質量和高效地獲得允許大量處理菌根真菌的液體產品，從而其能夠以合適且有益的劑量直接施用于定點灌溉系統之中。
為獲得這種接種物，發展了下列步驟1.播種Braquiaria decumbens、高粱(Sorghum vulgare)寄主植物或其他專性菌營養性(micotrophic)物種，它們在繁殖底質(土壤、高嶺土或蒙脫土、珍珠巖、zepeolite、蛭石和有機質(根據共生需求來施加))上生長。
2.通過將10克純品系的菌根真菌置于種子下而對這些植物進行直接接種，對于它們的生產，已經單獨地使用了下列物種束球囊霉(Glomus fasciculatum)、明球囊霉(Glomus clarum)、沾屑球囊霉(Glomus spurcum)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)、Glomusintrarradices、珠狀巨孢囊霉(Gigaspora margarita)以及球囊霉(Glomales)和Diversisporales的其他物種，但是也可以使用其他種類的菌根真菌。
3.在植物生活周期結束時，去處其頂部部分，并獲取由菌根繁殖體(定殖有真菌的根、真菌菌絲體和抗性孢子)和初始支持物的混合物組成的固體底質。
4.隨后，根據所使用的菌根真菌，采用濕傾析和過篩方法(通過從400至40um的數個篩)來提取菌根繁殖體；將在最細的篩中收集的固體級分離心，然后傾析出具有真菌繁殖體的液體級分。
5.當所有的菌根組分得以分離時，將它們用(2％)氯胺T溶液表面消毒5分鐘；將它們用無菌蒸餾水洗滌3次并置于硫酸鏈霉素中24小時。一旦結束，將它們裝入含有山梨糖醇(5至10％)、甘露醇(2％)、Tween40(5％)、Tween80(2％)、聚乙二醇4000(以100至500mg/L的范圍使用)和0.8至0.1％的瓊脂的含水混合物中。在這種情況下，能夠以直至每mL培養基中繁殖體單位的所允許的物理極限來生產該產品。
6.具有繁殖體的該含水溶液由下列要素組成a)活性組分-菌根繁殖體抗性孢子、叢枝狀表生菌絲體、Glomaline和定殖有目的真菌的小于40um的根；b)其他組分●5至10％的山梨糖醇；●2至5％的甘露醇；●5至7％的Tween40；●2至7％的Tween80；●以100至500mg/L的范圍使用的聚乙二醇；●0.8至0.1％的瓊脂。
一旦這些步驟結束，產品就準備好在田地中或通過定點灌溉系統施用了，其確保菌根繁殖體，特別是孢子免受表面滲透壓的影響，并確保當它們在水中施用時，它們能夠打破孢子的休眠機制并達到強的定殖能力，在農作物中得到陽性應答。
所提出的本發明由接種物組成，所述接種物根據其生產形式可以是高感染性的，因為可以達到非常高的濃度，該濃度除了允許該水中溶解的物理限制外沒有其他限制，或者為了方便施用，而達到1或2百萬個孢子/L以及1和2克菌絲體/L的等級的濃度。
此外，因為菌根繁殖體是在水性介質中，所以Glomaline的分泌受到刺激，其以高濃度存在于該接種物的組合物中，賦予了該接種物特殊的性質，因而當直接施用時加速了在土壤中形成穩定的微團聚體的過程，立刻改善了其物理結構，并增加了氧水平，這使得這種微生物能更好地定殖，確保了更加有效地形成菌根共生。
這種接種物促進該產品在土壤中的直接應用，在增加了其濃度的同時減少了其體積，這樣使得能對其進行操作和運輸，并減少工作。
將所述接種物置于濃縮的液體載體中，具有8個月的生存力，其可以完全地通過加肥灌溉系統進行施用，獲得均勻的分布，這通過不同規模的實驗得到檢驗。該事實保證了在灌溉系統的條件下對于所有植物的成功接種，這可通過顯著的產量增加而觀察到(參見技術報告)。
參考文獻●Dell Amico等人，Journal of Agricultural Science.2002.
●Feldmann，F和Idczak，E.Inoculum production ofVesicular-arbuscular Mycorrhizal Fungi for use in tropicalnurseries.InMethods in Microbiology.Volume 24 ISBN0-12-521524-x.Eds.Academic Press Limited.1992.
●Fernández，F.Capitulo 3.Bases Científico Técnicas parael manejo de los sistemas micorrizados eficientemente.EnRivera，Fernández，eds.INCA，La Habana.2003.
●Fernández，F等人，Patente 22641.OCPI.1999.
Sieverding，E.Vesicular Arbuscular Mycorrhiza in TropicalAgrosystem.Deutsche Gesellsschaft fur techniischeZusammenarbeit(GTZ)GMBH，federal Republic of Germany.1991.371 p.
權利要求
1.液體菌根接種物，其特征在于下列組成a.菌根繁殖體，其由抗性孢子、叢枝狀表生菌絲體、Glomaline和定殖有目的真菌的小于40um的根組成；b.5至10％的山梨糖醇；c.2至5％的甘露醇；d.5至7％的Tween 40；e.2至7％的Tween 80；f.以100至500mg/L的范圍使用的聚乙二醇；g.0.1％的瓊脂。
2.根據權利要求1的液體菌根接種物，其特征在于，其可以通過灌溉和加肥灌溉系統而施用在水中。
3.根據權利要求1的液體菌根接種物，其特征在于，其允許1或2百萬個孢子/L以及1和2克菌絲體/L的等級的濃度水平。
4.根據權利要求1的液體菌根接種物，其中所述的聚乙二醇可以以在4000至10000的范圍內的不同分子量進行使用，根據分子量，所述聚乙二醇具有在100至500mg/L的范圍內的溶解濃度。
全文摘要
本發明所涉及的領域為農業、土壤生物技術相關，并具體來說為叢枝狀菌根真菌的產生和應用，所述叢枝狀菌根真菌是改善植物營養攝取效率、水含量、農作物產量和針對一些根部疾病的保護作用等的微生物。本發明由施用給叢枝狀菌根真菌的液體產品組成，其使用能達到穩定菌根繁殖體的含水介質，由此使得能夠形成土壤團聚體并在液體介質中具有12至18個月的經證實的生存力，所述液體產品可用于灌溉或加肥灌溉系統中。本發明的接種物可直接施用于田地或處于保護栽培下的溫室，并且還可以用于克服孢子休眠機制和獲得增加的濃度水平，這使得能夠并促進操作和運輸。可以施用本發明的產品，以便在處于大規模灌溉系統下的農作物中管理菌根真菌，從而獲得改善的生產力和環境影響。
文檔編號C12N1/14GK101072739SQ200580042068
公開日2007年11月14日 申請日期2005年11月29日 優先權日2004年12月8日
發明者F·費爾南德斯馬丁, J·M·德拉米科羅德里格斯, Y·佩雷斯卡夫雷拉 申請人:國家農業科學院