專利名稱：無核荔枝嫁接砧木選擇新技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及果樹嫁接技術領域，具體涉及一種應用簡單序列重復(SimpleSequence Repeat，簡稱SSR)分子標記解決無核荔枝嫁接不親和問題的技術方法背景技術荔枝(Litchi chinensis Sonn.)為無患子科(Sapindaceae)荔枝屬(Litchi)植物，因其果實色澤鮮艷、肉質細嫩多汁、香甜可口而享譽中外，有“人間仙果”、“佛果”、“果王”的美稱。荔枝果肉的營養價值高，每100克果汁中含維生素C 36毫克、蛋白質0.7克、脂肪0.6克、碳水化合物14克，產生熱能267.7760千焦。中醫認為，荔枝味酸，性平偏溫，具有生津止渴、補氣養血、理氣止痛等功效，尤其對病后體虛、氣血不足、胃脘脹痛、胃陰不足及口渴咽干等癥具有神奇的醫療保健作用。因此民間常把荔枝作為藥療補品食用。除了用作食品外，其果實還可以用來釀酒；其花芳香多蜜，是理想的蜜源植物；樹皮、果皮、樹根含有大量單寧，可以工業用；百年荔枝的樹干是上好的木材，稱為“中國酸枝木”，非常珍貴。由于荔枝用途廣泛、經濟價值高，因此在我國水果業中具有重要的地位。
無核荔枝目前已在海南開始種植，但是其中有個嚴重的問題。用普通黑葉或其它荔枝實生苗作砧木進行嫁接繁殖，由于不親和現象突出，導致成活率很低，不到5％。顯然，嫁接不親和的問題已成為無核荔枝大面積推廣種植的限制因素。其實，不僅無核荔枝存在著嚴重的嫁接不親和問題，其它荔枝主栽品種在繁殖的時候，也存在一定的嫁接不親和現象。主要癥狀有①嫁接口腫大，上大下小明顯，愈合不正常；②嫁接口愈合基本正常，也有1～2次正常梢次，但以后只在梢端簇生短小枝梢，甚至抽生短小花穗，不能結果；③定植后苗木變黃，不能抽梢，長時間維持生而不長的狀況；④原來生長正常并已結果多年，隨著時間的推移，逐步表現嫁接口上下生長不平衡而出現地上部黃化、衰退的現象。像這些嫁接不親和的植株應該在早期就進行鑒定，然而傳統的砧穗搭配試驗周期長，成本高，難以快速有效地解決這個問題。而現代分子標記技術給迷茫中的我們帶來了希望。
影響荔枝嫁接親和性的因素很多，有遺傳因素、形態解剖學的因素和生理生化的因素，但主要是親緣關系的影響。一般認為，砧木與接穗的親緣關系越近，其形態結構和生理代謝途徑就越相似，嫁接面也就越容易愈合。基于這種考慮，我們開展了荔枝SSR分子標記的研究工作，并用自己開發的荔枝SSR標記對荔枝種質，包括無核荔枝、早熟荔枝、大果型荔枝的親緣關系進行了分析，從中找到了適于無核荔枝進行嫁接繁殖的砧木。
發明內容
本發明的目的在于提供一種無核荔枝嫁接砧木選擇新技術，即開發荔枝特異的SSR分子標記，用于鑒定和篩選與無核荔枝親緣關系相近的種質材料，確定最優接穗/砧木組合，有效解決無核荔枝嫁接不親和問題；荔枝嫁接砧木選擇新技術，應用荔枝特異SSR分子標記分析荔枝種質獲得一個嫁接效果好的無核荔枝砧穗組合；荔枝特異SSR分子標記采用以下技術步驟獲得一)、任用一種荔枝品種為材料采用選擇性擴增微衛星(Selectively AmplifiedMicrosatellite，簡稱SAM)法結合數據庫搜索法分離簡單序列重復(SimpleSequence Repeat，簡稱SSR)序列；二)、用SSR的側翼序列設計SSR引物采用Primer Premier 5.0軟件設計特異引物；引物設計參數為引物長度(18-24nt)、3’端穩定性(-5.5～-9.0kcal/mol)、引物Tm值(53-60℃)、GC含量(45～55％)、引物rating值＞90；三)、篩選有用引物，獲得荔枝特異性的簡單序列重復(SSR)標記。采用與步驟1相同的荔枝品種作材料，以其基因組DNA為模板，更換不同的簡單序列重復(SSR)引物進行擴增；采用以下反應程序94℃1分15秒、(57℃或55℃、53℃、51℃、45℃)不同的退火溫度1分15秒、72℃45秒，35次循環，反應體系20微升；PCR產物經5％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色，選出有強擴增帶的引物便是有用引物；其對應的擴增帶便是荔枝特異性的簡單序列重復(SSR)標記。同時選出每對引物最適宜的退火溫度；核酸引物序列見表1表1荔枝特異性SSR標記(基因座)及其引物表
根據所述的無核荔枝嫁接砧木選擇新技術；一個嫁接效果好的無核荔枝砧穗組合，采用以下技術步驟獲得一)、應用荔枝特異性的簡單序列重復(SSR)標記對部分荔枝種質進行遺傳多樣性分析；首先用改良的CTAB法提取多個荔枝種質的基因組DNA，然后用篩選出來的荔枝特異性的簡單序列重復(SSR)引物，對基因組DNA進行PCR擴增。采用以下反應程序94℃1分15秒、各引物最適宜的退火溫度1分15秒，72℃45秒，35次循環，反應體系總體積為20微升；PCR產物經5％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色；二)、數據分析1)、SSR標記分析及遺傳多樣性分析選擇擴增條帶清晰且有多態性的SSR標記進行數據統計，有帶記為“1”，無帶記為“0”；用MVSP 3.13f軟件根據Nei&Li(1979)的方法計算各種質間的相似系數(Genetic Similarity) (Nxy是種質x和y共有的譜帶數，Nx和Ny分別是種質x和種質y各自的譜帶數)2)、聚類分析采用UPGMA(Unweighted pair-group method using anarithmetic average)法，應用MVSP 3.13f軟件進行聚類分析；三)、根據數據分析結果，挑選親緣關系近的荔枝種質作砧木進行無核荔枝的嫁接繁殖；通過實驗驗證最后確定無核荔枝與A13號為最優接穗/砧木組合；當A13號荔枝種質的果實成熟以后，采果將種子取出，用水浸泡一天一夜，當胚根突破種皮時，播于苗床，苗床要遮蔭，第二年6月便可作砧木進行嫁接。
本發明的優點及有益效果是應用開發的荔枝SSR標記對荔枝種質，包括無核荔枝、早熟荔枝、大果型荔枝的親緣關系進行了分析，從中找到了適于無核荔枝進行嫁接繁殖的砧木。通過無核荔枝嫁接砧木選擇新技術進行無核荔枝的嫁接繁殖，使無核荔枝的接穗嫁接親和力好、繁殖形成同質的無性系，成活率高達95％。無核荔枝品種與妃子笑、糯米糍相比，它具有果大、早熟、種核退化、風味口感上佳等優點。
具體實施例方式
從以下實施例將進一步理解本發明1、材料來源以無核荔枝、A13號、無核丁香等32個海南特有的荔枝品種和白糖罌、妃子笑、黑葉等少數幾個廣東荔枝品種以及兩個龍眼主栽品種——石硤、儲良作為實驗材料。
2、方法(1)、分離SSR序列
1)用無核荔枝作材料，用選擇性擴增微衛星(Selectively AmplifiedMicrosatellite，SAM)法分離SAM片段，挑選100個SAM片段回收、克隆、測序，再用Sputnik軟件對測序結果進行分析，獲得SSR序列。
結果分析幾乎所有片段都含有SSR序列。其中，大部分測序片段含有二核苷酸CT/TC也就是AG/GA重復(這與SAM擴增時采用的SSR primer——PCT6相符)，且重復數多為6，這樣的片段占了80.1％。也有重復數為7、8、9、11、12、13、16的CT/TC序列；最多的達到18個CT重復，除了二核苷酸重復之外，個別序列中還含有三核苷酸重復、四核苷酸重復和五核苷酸重復。
2)、搜索GENEBANK和EMBL數據庫，查到5個與荔枝有關的基因序列，經Sputnik軟件分析，發現ID號為AF235949的菲律賓荔枝28S大亞基核糖體RNA基因序列中含有一段二核苷酸(GT)重復dinucleotide 476493--length 18score 9GTGTGTGTGCTGTGTGTG這是一段間隔微衛星序列，中間被一個胞嘧啶核苷酸所打斷。
(2)、設計SSR引物根據SSR的側翼序列采用Primer Premier 5.0軟件設計引物。共設計出70對引物。
(3)、有用引物的篩選，獲得荔枝特異性的SSR標記。用上述70對引物對無核荔枝的基因組DNA進行擴增。采用以下反應程序94℃1分15秒、(57℃或55℃、53℃、51℃、45℃)不同的退火溫度1分15秒、72℃45秒，35次循環，反應體系20微升。PCR產物經5％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色。結果為42對引物有強擴增帶，為有用引物。其對應的擴增帶便是荔枝特異性的SSR標記。同時選出每對引物最適宜的退火溫度。核酸引物序列見表1表1荔枝特異性SSR標記(基因座)及其引物表
(4)、應用荔枝特異性的SSR標記對37個荔枝種質和2個龍眼種質進行遺傳多樣性分析。首先用改良的CTAB法提取所有供試材料的基因組DNA，，然后用篩選出來的荔枝特異性SSR引物對基因組DNA進行擴增。采用以下反應程序94℃1分l5秒、各引物最適宜的退火溫度1分15秒，72℃45秒，35次循環，反應體系總體積為20微升。PCR產物經5％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色。
(5)、數據分析用17個荔枝特異性SSR引物對基因組DNA進行擴增，選取清晰、明顯、可重復的強擴增帶用于二維數據統計，強帶記為“1”，無帶或弱帶記為“0”。共涉及18個SSR位點，檢測到46個等位基因的變異和4個非等位基因的變異(與龍眼有關)。根據SSR分析結果應用MVSP 3.13f軟件計算37個荔枝栽培品種和2個龍眼主栽品種的遺傳相似系數(GS)，獲得遺傳相似性矩陣其范圍在0～1之間，平均0.567。無核荔枝與A13號之間的遺傳相似系數為0.762，大于無核荔枝與兩個黑葉實生苗之間的相似性(與黑葉尖是0.714，與黑葉圓是0.6)。
(6)、根據數據分析結果，選出親緣關系近的荔枝種質A13號作砧木、無核荔枝作接穗進行芽接。每年6月中旬采集A13號種子，用水浸泡一天一夜當胚根突破種皮時，播于苗床，苗床要遮蔭，第二年6月便可作砧木進行嫁接。
權利要求
1.無核荔枝嫁接砧木選擇新技術，其特征在于應用荔枝特異SSR分子標記分析荔枝種質獲得一個嫁接效果好的無核荔枝砧穗組合；荔枝特異SSR分子標記采用以下技術步驟獲得一)、任用一種荔枝品種為材料，采用選擇性擴增微衛星(Selectively AmplifiedMicrosatellite，簡稱SAM)法結合數據庫搜索法分離簡單序列重復(SimpleSequence Repeat，簡稱SSR)序列；二)、用SSR的側翼序列設計SSR引物采用Primer Premier 5.0軟件設計特異引物；引物設計參數為引物長度(18-24nt)、3’端穩定性(-5.5～-9.0kcal/mol)、引物Tm值(53-60℃)、GC含量(45～55％)、引物rating值＞90；三)、篩選有用引物，獲得荔枝特異性的簡單序列重復(SSR)標記。采用與步驟1相同的荔枝品種作材料，以其基因組DNA為模板，更換不同的簡單序列重復(SSR)引物進行擴增；采用以下反應程序94℃1分15秒、(57℃或55℃、53℃、51℃、45℃)不同的退火溫度1分15秒、72℃45秒，35次循環，反應體系20微升；PCR產物經5％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色，選出有強擴增帶的引物便是有用引物；其對應的擴增帶便是荔枝特異性的簡單序列重復(SSR)標記。同時選出每對引物最適宜的退火溫度；核酸引物序列見表1表1 荔枝特異性SSR標記(基因座)及其引物表
2.根據權利要求所述的無核荔枝嫁接砧木選擇新技術；一個嫁接效果好的無核荔枝砧穗組合，采用以下技術步驟獲得一)、應用荔枝特異性的簡單序列重復(SSR)標記對部分荔枝種質進行遺傳多樣性分析；首先用改良的CTAB法提取多個荔枝種質的基因組DNA，然后用篩選出來的荔枝特異性的簡單序列重復(SSR)引物，對基因組DNA進行PCR擴增。采用以下反應程序94℃1分15秒、各引物最適宜的退火溫度1分15秒，72℃45秒，35次循環，反應體系總體積為20微升；PCR產物經5％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色；二)、數據分析1)、SSR標記分析及遺傳多樣性分析選擇擴增條帶清晰且有多態性的SSR標記進行數據統計，有帶記為“1”，無帶記為“0”；用MVSP 3.13f軟件根據Nei&Li(1979)的方法計算各種質間的相似系數(Genetic Similarity) (Nxy是種質x和y共有的譜帶數，Nx和Ny分別是種質x和種質y各自的譜帶數)2)、聚類分析采用UPGMA(Unweighted pair-group method using anarithmetic average)法，應用MVSP 3.13f軟件進行聚類分析；三)、根據數據分析結果，挑選親緣關系近的荔枝種質作砧木進行無核荔枝的嫁接繁殖；通過實驗驗證最后確定無核荔枝與A13號為最優接穗/砧木組合；當A13號荔枝種質的果實成熟以后，采果將種子取出，用水浸泡一天一夜，當胚根突破種皮時，播于苗床，苗床要遮蔭，第二年6月便可作砧木進行嫁接。
全文摘要
本發明公開了無核荔枝嫁接砧木選擇新技術。發明步驟一)、采用選擇性擴增微衛星(SAM)結合數據庫搜索法分離簡單序列重復(SSR)序列；二)、用簡單序列重復(SSR)序列的側翼序列設計SSR引物；三)、篩選有用引物，獲得荔枝特異性的簡單序列重復(SSR)標記；四)、應用荔枝特異性的簡單序列重復(SSR)標記對部分荔枝種質進行遺傳多樣性分析；五)、數據分析；六)、根據數據分析結果，挑選親緣關系近的荔枝種質作砧木進行無核荔枝的嫁接繁殖。通過無核荔枝嫁接砧木選擇新技術進行無核荔枝的嫁接繁殖，使無核荔枝的接穗嫁接親和力好、繁殖形成同質的無性系，成活率高達95％。無核荔枝品種與妃子笑、糯米糍相比，它具有果大、早熟、種核退化、風味口感上佳等優點。
文檔編號A01G1/06GK1887048SQ20051008081
公開日2007年1月3日 申請日期2005年6月28日 優先權日2005年6月28日
發明者李明芳, 鄭學勤, 吳新榮, 王高, 羅振標, 洪鋼池 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所, 海南陸僑農牧開發有限公司