專利名稱：擬南芥的培養方法
技術領域：
本發明涉及擬南芥的培養方法，特別是涉及一種在人工氣候箱中培養擬南芥的方法。
背景技術：
擬南芥由于植株形體小，生活周期短，結實率高以及基因組小等特點，長期以來一直被作為遺傳學、發育生物學和分子生物學的模式材料使用，被譽為植物界的“果蠅”。以擬南芥為材料進行實驗，培養出健壯、無病蟲害感染的植株是實驗成功的基礎。
通常，可以在溫室、室內或人工氣候箱中對擬南芥進行培養。擬南芥的生長發育對各種環境因子(如溫度、濕度、光照等)的變化特別敏感，同時也非常容易感染病蟲害，因此，較難培養出健壯、無病蟲害感染植株。由于溫室和室內各種環境因子的變異幅度很大，同時又很容易出現病蟲害交叉感染，所以在溫室或室內環境條件下，植株的生長發育速度往往難以控制，長勢也很弱，并且病蟲害感染嚴重。但是，在人工氣候箱中各種環境因子都可以得到比較精確地控制；同時，箱體內環境與外界隔離可以有效地避免病蟲害感染。雖然目前有一些實驗室利用人工氣候箱培養擬南芥，但培養出來的植株的生長狀況仍然達不到實驗要求，致使很多實驗進程由于擬南芥的生長狀況未達到實驗要求而受到影響，因此，迫切需要一種在人工氣候箱中培養健壯、無病蟲害感染的擬南芥的有效方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種可在人工氣候箱中重復培養出健壯、無病蟲害感染的擬南芥的方法。
本發明所提供的擬南芥的培養方法，包括以下步驟 1)對種子進行滅菌，然后將種子在2-4℃、濕潤、黑暗條件下春化處理1-3天； 2)將經滅菌的培養基質裝到經滅菌的培養盆中，然后將培養盆放在盛有水的托盤中，靜置12-24小時，使基質通過毛細作用充分吸足水，基質水分飽和后，將托盤中剩余的水倒出，將種子播到基質表面； 3)將播種后的培養盆連同底部托盤置于經滅菌的人工氣候箱中，調節人工氣候培養箱的環境因子控制器，使光周期為15-17小時光照，7-9小時黑暗；光強為300-400μmol m-2s-1；光照條件下的溫度為22-24℃，相對濕度為70-90％；黑暗條件下的溫度為18-20℃，相對濕度大于90％，經培育得到擬南芥植株。
在上述培養方法中，步驟1)對種子進行滅菌的方法可為先將種子用70％乙醇(V/V)浸泡30秒，然后倒出乙醇，立即用7％NaClO(W/V)溶液浸泡10分鐘，最后將種子用蒸餾水清洗4-6次，每次30s。較優選的春化條件為將種子放在濕潤濾紙上，在4℃下避光處理2天。
步驟2)中所用的水優選為蒸餾水或去離子水。可采用常規的培養基質對擬南芥進行培養，如將普通市售花卉培養土與蛭石按2-3∶3-2的比例混合后得到的混合物，所述普通市售花卉培養土中的N、P和K總含量高于2.65％，有機質含量高于45％，腐殖酸含量高于9％，蛭石顆粒直徑可為3-4mm。對培養基質進行滅菌的方法可為在121-123℃下高壓滅菌20-30分鐘，優選為25分鐘；對培養盆進行滅菌的方法可為將培養盆用按1∶2500-3500比例稀釋的“84”消毒液浸泡至少2小時，然后用水將殘留的消毒液清洗干凈。播種前最好向基質表面再噴灑一些水，使基質表面濕潤。
步驟3)中對人工氣候箱進行滅菌的方法可為先用水將人工氣候箱清洗干凈，再在箱體內噴灑70％乙醇(V/V)，關閉箱門殺菌12-24小時，最后開門通氣，使箱體內的乙醇完全揮發，以避免殘余乙醇對苗產生毒害作用。在培育過程中，可根據擬南芥植株生長發育所需的最適環境因子對人工氣候箱中各種環境因子的數值進行設置，人工氣候箱中各環境因子的數值優選為光周期為16小時光照，8小時黑暗；光強為350μmol m-2s-1；光照條件下的溫度為23℃，相對濕度為80％；黑暗條件下的溫度為19℃，相對濕度95％。
此外，由于人工氣候箱對濕度的調控能力有限，可在箱體外面再添加一個加濕器，以保證箱體內的相對濕度在適宜范圍內。加濕器可位于人工氣候箱旁邊的地面上，在臨近加濕器的人工氣候箱的一個側面設置一個圓孔，用一根輸料管連接加濕器排氣孔和人工氣候箱圓孔；所述輸料管直徑與人工氣候箱側面上的圓孔孔徑相同。
植株在生長過程中，可每隔2-4天將培養盆在人工氣候箱中的位置隨機更換一次，每隔5-7天澆一次水。
此外，為使擬南芥長得更加健壯，可在幼苗長出2片真葉和植株剛抽苔時施加液體肥料，并將盆中的表面土層輕輕松動；所述液體肥料可為1/2MS培養液或1/2Hoagland培養液等。
所述澆水和施肥的方法為將水或液體肥料倒入托盤中，靜置12-24小時，盆中基質通過毛細作用吸收水分或養分，然后將托盤中剩余的水或液體肥料倒出。
上述培養方法對任意生態型的野生型擬南芥及其突變體均適用，包括Columbia、WS和Ler等。
本發明提供了一種在人工氣候箱中培養擬南芥的方法。在本發明的培養方法中，對種子、培樣基質、培養盆、培養箱等進行滅菌處理是為避免擬南芥植株受到病蟲害感染；對種子進行春化處理是為保證種子的萌發時間比較一致；精確控制人工氣候箱中的各種環境因子的數值，定期隨機改變培養盆在箱體內的位置、澆水、施肥及松土是為保證擬南芥植株健壯生長，同時也可防止病蟲在基質表層繁殖，進一步降低感染病蟲害的可能性；此外，利用毛細作用吸收水分或營養液可以避免直接澆水對基質的沖刷。實驗證明，用本發明方法培育擬南芥，約40天就可以獲得健壯、無病蟲害感染的開花的擬南芥植株，約60天種子開始成熟，整個生活周期約100天，且用該方法培育的擬南芥植株不僅生長健壯、無病蟲害感染，同時各個世代的植株生長發育速率及各種形態指標的重復性較好，完全能夠滿足各種實驗的要求。本發明具有重復性好、簡單易行的優點，將在擬南芥的培育中發揮重要作用，應用前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
圖1為擬南芥在人工氣候箱中萌芽后40天的生長狀況
具體實施例方式 下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
實施例1、擬南芥的培育 現用本發明的方法在人工氣候箱中培育擬南芥，包括以下步驟 1)擬南芥種子的滅菌先將生態型為Columbia的擬南芥種子用70％乙醇(V/V)浸泡30秒，然后倒出乙醇，立即用7％NaClO(W/V)溶液浸泡10分鐘，最后將種子用蒸餾水清洗5次，每次30s。
2)春化處理將經滅菌的種子放在底部墊濕潤濾紙的培養皿中(不要讓水把種子淹沒)，放在4℃冰箱中避光處理2天。
3)在121℃下對培養基質高壓滅菌25分鐘；將培養盆用按1∶3000比例稀釋的“84”消毒液浸泡4小時，然后用自來水將殘留的消毒液清洗干凈。
4)將經滅菌的培養基質裝到經滅菌的培養盆中，然后將培養盆放在盛有蒸餾水的托盤中，靜置12-24小時，使基質通過毛細作用充分吸足水，基質水分飽和后，將托盤中剩余的水倒出，向基質表面噴灑少許蒸餾水使基質表面濕潤即可，用牙簽將種子播到基質表面(不要讓種子被基質覆蓋，因為種子萌發需要光)； 5)對人工氣候箱進行滅菌先用水將人工氣候箱清洗干凈，再在箱體內噴灑70％乙醇(V/V)，關閉箱門殺菌12-24小時，最后開門通氣，使箱體內的乙醇完全揮發，以避免殘余乙醇對苗產生毒害作用。
6)將播種后的培養盆連同底部托盤置于經滅菌的人工氣候箱中，調節人工氣候培養箱的環境因子控制器，使光周期為16小時光照，8小時黑暗；光強為350μmol m-2s-1；光照條件下的溫度為23℃，相對濕度為80％；黑暗條件下的溫度為19℃，相對濕度95％。由于人工氣候箱對濕度的調控能力有限，再在箱體外面再添加一個加濕器，加濕器位于人工氣候箱左側地面上，人工氣候箱左側面離地面40cm處有一個直徑為3cm的圓孔，一根直徑3cm輸料管連接加濕器和人工氣候箱圓孔，其中加濕器電源插頭與培養箱背部所附有的電源插座相連接，以協助調控箱體內的相對濕度。
7)每隔3天將培養盆在人工氣候箱中的位置隨機更換一次，每隔6天澆一次水，澆水的方法為將水倒入托盤中，靜置12-24小時，然后將托盤中剩余的水倒出。
8)在幼苗長出2片真葉和植株剛抽苔時施加1/2MS培養液，施肥方法與步驟7)的澆水方法相同，同時將盆中的表面土層用牙簽輕輕松動。
播種后約40天，植株就可以開花(如圖1所示)，60天后角果中種子就開始成熟，整個生活周期約100天，證明用本發明的培養方法可得到健壯、無病蟲害感染的擬南芥植株。
權利要求
1、一種擬南芥的培養方法，包括以下步驟
1)對種子進行滅菌，然后將種子在2-4℃、濕潤，黑暗條件下春化處理1-3天；
2)將經滅菌的培養基質裝到經滅菌的培養盆中，然后將培養盆放在盛有水的托盤中，靜置12-24小時后將托盤中多余的水分倒出，將經步驟1)處理的種子播到基質表面；
3)將播種后的培養盆連同底部托盤置于經滅菌的人工氣候箱中，調節人工氣候培養箱的環境因子控制器，使光周期為15-17小時光照，7-9小時黑暗；光強為300-400μmol m-2s-1；光照條件下的溫度為22-24℃，相對濕度為70-90％；黑暗條件下的溫度為18-20℃，相對濕度大于90％，經培育得到擬南芥植株。
2、根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于所述步驟1)對種子進行滅菌的方法為先將種子用體積百分濃度為70％乙醇浸泡30秒，然后倒出乙醇，用質量百分濃度為7％NaClO溶液浸泡10分鐘，最后將種子用蒸餾水清洗4-6次，每次30s；所述春化條件為將種子放在濕潤濾紙上，在4℃下避光處理2天。
3、根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于所述步驟2)中的水為蒸餾水或去離子水；所述培養基質為將市售花卉培養土與蛭石按2-3∶3-2的比例混合后得到的混合物，所述市售花卉培養土中的N、P和K總含量高于2.65％，有機質含量高于45％，腐殖酸含量高于9％，蛭石顆粒直徑為3-4mm；對培養基質進行滅菌的方法為在121-123℃下高壓滅菌20-30分鐘；對培養盆進行滅菌的方法為先將培養盆用按1∶2500-3500比例稀釋的“84”消毒液浸泡至少2小時，再用水沖掉殘留的消毒液；播種前向基質表面噴灑水。
4、根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于所述步驟3)中對人工氣候箱進行滅菌的方法為先用水對人工氣候箱進行清洗，再在箱體內噴灑體積百分濃度為70％乙醇，關閉箱門殺菌12-24小時，最后開門通氣；將人工氣候箱中各環境因子的數值設為光周期為16小時光照，8小時黑暗；光強為350μmol m-2s-1；光照條件下的溫度為23℃，相對濕度為80％；黑暗條件下的溫度為19℃，相對濕度95％。
5、根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于在所述人工氣候箱箱體外面添加一個加濕器，加濕器位于人工氣候箱旁邊的地面上，在臨近加濕器的人工氣候箱的一個側面設置一個圓孔，用一根輸料管連接加濕器排氣孔和人工氣候箱圓孔；所述輸料管直徑與人工氣候箱側面上的圓孔孔徑相同。
6、根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于每隔2-4天將培養盆在人工氣候箱中的位置隨機更換一次，每隔5-7天澆一次水；所述澆水的方法為將水倒入托盤中，靜置12-24小時，然后將托盤中剩余的水倒出。
7、根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于在幼苗長出2片真葉和植株剛抽苔時施加液體肥料，并將盆中的表面土層輕輕松動；所述液體肥料為1/2MS培養液或1/2Hoagland培養液；所述施肥的方法為將液體肥料倒入托盤中，靜置12-24小時，然后將托盤中的剩余液體倒出。
8、根據權利要求1-7任一項所述的培養方法，其特征在于所述擬南芥包括野生型擬南芥及其突變體。
9、根據權利要求8所述的培養方法，其特征在于所述擬南芥的生態型為Columbia、WS或Ler。
全文摘要
本發明公開了擬南芥的培養方法。該方法包括以下步驟1)對種子進行滅菌，然后將種子在2－4℃、濕潤，黑暗條件下春化處理1－3天；2)將經滅菌的培養基質裝到經滅菌的培養盆中，然后將培養盆放在盛有水的托盤中，靜置12－24小時后將托盤中多余的水分倒出，再向基質表面噴灑水，將種子播到基質表面；3)將播種后的培養盆連同底部托盤置于經滅菌的人工氣候箱中，調節人工氣候培養箱的環境因子控制器，使光周期為15－17小時光照，7－9小時黑暗；光強為300－400μmol m－2s－1；光照條件下的溫度為22－24℃，相對濕度為70－90％；黑暗條件下的溫度為18－20℃，相對濕度大于90％，經培育得到擬南芥植株。
文檔編號A01G31/00GK1902997SQ20061008909
公開日2007年1月31日 申請日期2006年8月2日 優先權日2006年8月2日
發明者林金星, 滕年軍, 汪玉清, 侯桂玲 申請人:中國科學院植物研究所