專利名稱：一種巨尾桉轉化方法
技術領域：
本發明涉及一種桉樹轉化方法，特別是巨尾桉轉化方法。
背景技術：
桉樹是桃金娘科Myrtaceae桉屬Eucalyptus植物的統稱,常綠喬木,為世界三大速生造林樹種之一。桉樹原產于澳洲，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區，具有速生豐產、適應性廣等特點。在我國，桉樹主要分布于海南、福建及兩廣地區，是我國南方應用最廣的造林及經濟樹種。然而，在中亞熱帶地區，低溫凍害是按樹引種、擴大栽培與速生豐產的主要限制因子。因此，按樹的抗寒品種選育，尤其選擇適合我國既耐寒、經濟價值又高的優良按樹種/種源向北推移，擴大引種栽培范圍，加快按樹產業的發展就成為育種的重要目的之一。1991年Teulieres C等首次在岡尼桉(Eucalyptus gunnii)原生質體上、轉化報告基因，目前已對岡尼桉、朽1檬桉(E. citriodora)、藍桉(E. globulus)、赤桉(E. camaldulensis)、巨桉(E. grandis)、尾葉桉(E. urophylla)等進行了遺傳轉化的研究。另外，近年來桉樹高效再生體系的建立、高密度基因圖譜構建以及分子標記的快速發展為桉樹轉基因研究提供了條件和依據。傳統的農桿菌介導轉化法在桉樹的轉基因研究中是比較有效的方法之一，目前通過根癌農桿菌介導法已經對巨桉、鄧恩桉、亮果桉、赤桉、巨尾桉和尾巨桉等10幾種桉樹中進行了轉基因研究。但它仍舊面臨著轉化效率較低、再生技術的限制(只在赤桉、巨桉等少數幾個種中有轉基因植株的報道，在其它桉樹品種中報道較少)、外源基因表達的時空調控、轉基因植株對環境的生物安全性等諸多問題。因此，探索改良新的轉化體系，提高轉化效率成為桉樹轉基因技術是否可以將理論研究付諸于造林應用的一個重要內容。甘露糖磷酸異構酶(phosphomannose isomerase,PMI)基因在自然界中廣泛存在，而除肉桂(Cinnamomum cassia)和一些豆類外，自然界的植物中大都沒有編碼PMI的基因。因而以甘露糖為篩選劑的正向篩選系統在包括桉樹在內的絕大多數植物的遺傳轉化中都是可用的。PMI作為一種正向篩選標記，其本身對植物是無害的。當培養基中加入適當比例的甘露糖/蔗糖時，轉化植株可以將甘露糖轉化為6-磷酸果糖，作為碳源供植株生長；而非轉化植株則會因為碳源的缺乏呈現出相對的生長劣勢，繼而與轉基因植株區分開來。另夕卜，與以住的除草劑、抗生素相比，PMI標記基因的生物安全性得以保障，這一點對于作為造林樹種的桉樹尤為重要。而且，將安全性標記基因PMI應用于桉樹的研究目前國內國際均未見報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種安全高效的巨尾桉遺傳轉化方法，以便解決現有技術中所述農桿菌介導法轉化桉樹所遇到的問題。本發明通過構建以安全性標記基因PMI (6-磷酸甘露糖異構酶)為篩選標記的表達載體，通過大量的組培試驗及對遺傳轉化方法的改進，最終將目的基因AmCBLl成功轉入巨尾桉中。該目的基因來源于超旱生植物沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.) Cheng f.),由其特異性啟動子 AmCBLlP 所驅動，該
啟動子功能已經驗證。本發明的目的是通過如下方式實現的一種巨尾桉轉化方法，包括以下步驟(I)將目的基因連入含有6-磷酸甘露糖異構酶(PMI)的表達載體pCAMBIA1301上，將所述載體導入根癌農桿菌EHA105 ；
(2)將所述農桿菌于含有100mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的YEB培養基中，28°C, 180轉/分鐘，避光搖至OD值為O. 4 O. 6 ；8000轉/分鐘，離心10分鐘，沉淀收集菌體；(3)使用含有乙酰丁香酮(Acetosyringone,以下簡稱AS) 50mg/L、2-(N_嗎啡啉)乙磺酸150mg/L和半乳糖I. 8g/L的無鹿糖MS液體培養基懸浮菌體,懸浮后的菌液OD值仍調至0. 4 0. 7 ;(4)取巨尾桉組培苗莖段，剪為0. 5厘米左右，接種于預培養愈傷誘導培養基中，在溫度為25±2°C的培養室中，暗培養I天，進行預培養；(5)取懸浮后的菌液侵染經預培養的巨尾桉莖段，侵染時間為4 7分鐘；侵染后接種至共培養愈傷誘導培養基中，在溫度為25±2°C的培養室中，暗培養3天中，進行共培養;(6)將共培養后的莖段轉接至篩選階段的愈傷誘導培養基中，在溫度為25±2°C的培養室中，暗培養40 45天，進行選擇性培養；(7)統計選擇性培養后的愈傷組織誘導率，將產生的愈傷組織接至篩選階段的分化培養基中，在光照強度為1500 2000勒克斯、光周期為18小時/天、溫度為25±2°C的培養室內進行芽分化培養；(8)約25 30天后，將分化得到的芽編號，并移入新的篩選階段的分化培養基中繼續進行分化培養；(9)取分化培養中高約2厘米左右的小芽，接入篩選階段的生根培養基中，在光照強度為1500 2000勒克斯、光周期為18小時/天、溫度為25±2°C的培養室內進行生根培養，40 45天后將生根巨尾桉幼苗移入土中；(10)取經篩選培養得到的巨尾桉株系葉片進行氯酚紅檢測，轉化成功的株系的檢測液產生變色反應；用轉化成功的株系提取DNA，以AmCBLl基因正向引物AmCBLl-I和反向引物AmCBLl-2為引物，經PCR反應進行轉基因鑒定，確定這些株系的DNA中是否獲得了目的基因。其中，所述目的基因是AmCBLl基因，所述目的基因來源于超旱生植物沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.) Cheng f.)，該基因由其特異性啟動子 AmCBLlP所驅動。所述懸浮后的菌液OD值優選仍調至0. 5 0. 6。所述侵染時間優選為5 6分鐘。所述預培養愈傷誘導培養基是含苯基噻二唑脲(Thidiazuron,以下簡稱TDZ)0. 5mg/L、蔡乙酸(1-naphthlcetic acid,以下簡稱 NAA)0. lmg/L、鹿糖 30g/L 和瓊脂7g/L的MS培養基。
所述共培養愈傷誘導培養基是含羧芐青霉素(Carbenicillin，以下簡稱Car) 200mg/L、TDZ O. 5mg/L、NAA O. lmg/L、蔗糖 30g/L 和瓊脂 7g/L 的 MS 培養基。所述篩選階段的愈傷誘導培養基是含有Car 200mg/L、TDZ O. 5mg/L、NAA O. lmg/L、蔗糖19g/L、甘露糖llg/L和瓊脂7g/L的MS培養基。所述篩選階段的分化培養基中是含有Car 200mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖llg/L和瓊脂7g/L的MS培養基。 所述篩選階段的生根培養基是含有Car 200mg/L、IBA O. 5mg/L、NAA O. 5mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖llg/L和瓊脂7g/L的1/2MS培養基。AmCBLl 基因正向引物 AmCBLl-I 的序列為ATGGGGTGCT TCAACTCTAA反向引物AmCBLl-2 為引物的序列為TCAAGCAGCA ACTTCATCC組培基礎I.巨尾桉的愈傷誘導敏感性試驗為獲得巨尾桉愈傷組織誘導所最適宜的生根培養基配方，本實驗選用TDZ與NAA，按以下激素配比配制愈傷組織誘導培養基表I培養基莖段葉片
TDZ(mg/L)NAA(mg/L)愈傷_^^_
0.1正常4/10無
0.10.1發紅3/10無
0.1_03_ML_1/10_^_
0.3正常4/10無
0.30.1正常1/10無 0.3_03_M_1/10_^_
0.5好1/10無
0.50.1好8/10無
0.5_03_M_7/10_^_
0.6正常1/10無
0.60.1不好3/10無
0.6_03_W_2/10_^_
0.7正常2/10無
0.70.1不好無無
0.7_03_W_^^_
0.8正常無無
0.80.1紅1/10無
0.8_03_^_3/10_^_
0.9 紅 1/10 無0.9 0.1 紅 1/10 無
0.9_03_^_2/10_^_
1.0好1/10無
1.00.1稍紅3/10無
1.0_03_IMl_3/10_^_
1.5好無無
1.50.1稍紅無無
1.5_03_IMl_1/10_^_由表I可知，巨尾桉葉片幾乎沒有愈傷組織的分化，而莖段分化愈傷組織的能力要明顯好于葉片。另外，TDZ對巨尾桉的愈傷組織誘導均具有顯著的影響。TDZ的濃度取
O.5mg/L最為適宜，過低濃度的TDZ會使愈傷組織發紅，而過高濃度的TDZ則導致愈傷組織的芽分化率明顯降低。NAA對對巨尾桉的愈傷組織誘導影響不甚顯著，但適當濃度的NAA會增加芽的分化率。因此，最終選擇的最佳愈傷誘導培養基為MS+TDZa5mg/L+NAA0. lmgA。
注培養基中加入蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，調至PH7。操作方法剪取長度約Icm桉樹莖段(無側枝)，及長寬均約O. 5cm的桉樹葉片，于25°C組培室，先黑暗培養30天后光照培養，統計愈傷生長情況。2.巨尾桉的生根培養試驗為獲得巨尾桉生根培養所最適宜的生根培養基配方，本實驗選用NAA與IBA，按以下激素配比配制生根培養基
表 權利要求
1.一種巨尾桉轉化方法，包括以下步驟 (1)將目的基因連入含有6-磷酸甘露糖異構酶(PMI)的表達載體PCAMBIA1301上，將所述載體導入根癌農桿菌EHA105 ； (2)將所述農桿菌于含有100mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的YEB培養基中，28°C，180轉/分鐘，避光搖至OD值為O. 4 O. 6 ；8000轉/分鐘，離心10分鐘，沉淀收集菌體； (3)使用含有乙酰丁香酮50mg/L、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸150mg/L和半乳糖I.8g/L的無蔗糖MS液體培養基懸浮菌體，懸浮后的菌液OD值仍調至O. 4 O. 7 ; (4)取巨尾桉組培苗莖段，剪為O.5厘米左右，接種于預培養愈傷誘導培養基中，在溫度為25±2°C的培養室中，暗培養I天，進行預培養； (5)取懸浮后的菌液侵染經預培養的巨尾桉莖段，侵染時間為4 7分鐘；侵染后接種至共培養愈傷誘導培養基中，在溫度為25 ± 2°C的培養室中，暗培養3天中，進行共培養； (6)將共培養后的莖段轉接至篩選階段的愈傷誘導培養基中，在溫度為25±2°C的培養室中，暗培養40 45天，進行選擇性培養； (7)統計選擇性培養后的愈傷組織誘導率，將產生的愈傷組織接至篩選階段的分化培養基中，在光照強度為1500 2000勒克斯、光周期為18小時/天、溫度為25±2°C的培養室內進行芽分化培養； (8)約25 30天后，將分化得到的芽編號，并移入新的篩選階段的分化培養基中繼續進行分化培養； (9)取分化培養中高約2厘米左右的小芽，接入篩選階段的生根培養基中，在光照強度為1500 2000勒克斯、光周期為18小時/天、溫度為25±2°C的培養室內進行生根培養，40 45天后將生根巨尾桉幼苗移入土中； (10)取經篩選培養得到的巨尾桉株系葉片進行氯酚紅檢測，轉化成功的株系的檢測液產生變色反應；用轉化成功的株系提取DNA，以AmCBLl基因正向引物AmCBLl-I和反向引物AmCBLI-2為引物，經PCR反應進行轉基因鑒定，確定這些株系的DNA中是否獲得了目的基因。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述目的基因來源于超旱生植物沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.) Cheng f.)，該基因由其特異性啟動子AmCBLlP所驅動。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述懸浮后的菌液OD值仍調至O.5 O. 6。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述侵染時間為5 6分鐘。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述預培養愈傷誘導培養基是含苯基噻二唑服(Thidiazuron,以下簡稱 TDZ)0. 5mg/L、萘乙酸(1-naphthlcetic acid,以下簡稱NAA) 0. lmg/L、蔗糖30g/L和瓊脂7g/L的MS培養基。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述共培養愈傷誘導培養基是含羧芐青霉素(Carbenici 11 in,以下簡稱 Car) 200mg/L> TDZ 0. 5mg/L、NAA 0. lmg/L、鹿糖 30g/L 和瓊脂7g/L的MS培養基。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述篩選階段的愈傷誘導培養基是含有Car200mg/L、TDZ 0. 5mg/L、ΝΑΑ0. lmg/L、蔗糖 19g/L、甘露糖 llg/L 和瓊脂 7g/L 的 MS 培養基。
8.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述篩選階段的分化培養基中是含有Car200mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖llg/L和瓊脂7g/L的MS培養基。
9.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述篩選階段的生根培養基是含有Car200mg/L、IBA O. 5mg/L、NAA O. 5mg/L、蔗糖 19g/L、甘露糖 llg/L 和瓊脂 7g/L 的 1/2MS 培養基。
全文摘要
本發明提供了一種安全高效的巨尾桉遺傳轉化方法，以便解決現有技術中所述農桿菌介導法轉化桉樹所遇到的問題。本發明通過構建以安全性標記基因PMI(6-磷酸甘露糖異構酶)為篩選標記的表達載體，通過大量的組培試驗及對遺傳轉化方法的改進，最終將目的基因AmCBL1成功轉入巨尾桉中。該目的基因來源于超旱生植物沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus(Maxim.)Cheng f.)，由其特異性啟動子AmCBL1P所驅動。
文檔編號A01H5/00GK102660575SQ201210019229
公開日2012年9月12日 申請日期2012年1月20日 優先權日2012年1月20日
發明者夏新莉, 尹偉倫, 龐濤 申請人:北京林業大學