專利名稱：一種選育具有抗白斑綜合癥病毒特性的凡納濱對蝦親蝦的方法
技術領域：
本發明涉及一種選育具有抗白斑綜合癥病毒特性的凡納濱對蝦親蝦的方法。
背景技術：
凡納濱對蝦是重要的海水經濟蝦類，因其生長速度快、抗病能力強、市場價值高等特點深受水產養殖者的重視，近年來的養殖規模越來越大。但是，隨著養殖規模的增加和水環境污染的加劇，凡納濱對蝦養殖過程中的病害也時有發生，其中對養殖造成危害最大的是凡納濱對蝦白斑綜合癥(white spotsyndrome，簡稱WSS)。對蝦白斑綜合癥是由白斑綜合癥病毒(white spotsyndrome virus，簡稱WSSV)引起的，目前還沒有有效的藥物來防治WSSV，因此控制WSS暴發的主要方法在于預防。在生產中人們發現，凡納濱對蝦種群中有部分對蝦具有抗WSSV的能力，這部分對蝦在感染WSSV后能夠健康存活，并且子代也具有抗病毒的特性，被稱為SPR(special pathogen resistance)種群。因此，在凡納濱對蝦親蝦中篩選具有抗WSSV能力的個體進行繁殖，利用其種苗的抗病毒特性來防止對蝦白斑綜合癥的發生是保證凡納濱對蝦養殖業可持續發展的重要措施之一。而目前，具有抗WSSV能力的凡納濱對蝦親蝦的篩選方法還沒有見到。
發明內容本發明的目的是提供一種選育具有抗WSSV特性的凡納濱對蝦親蝦的方法。
本發明的具有抗WSSV特性的凡納濱對蝦親蝦選育方法的具體步驟如下
1)親蝦選擇與暫養按照雌雄比為1∶2的比例選擇健康親蝦。所述的健康親蝦體長為14～18cm、體重為35～40g、體型大、體色正常、副肢完整、鰓部清潔。所述的親蝦暫養的優選方法為按照30～50尾/箱的密度將親蝦放入室內體積為1000L的PVC水族箱內，水族箱內的用水必須先經過臭氧消毒、紫外線消毒和孔徑1～5μm精密過濾器的處理，按照1L/分鐘的速度進行微流水換水，在整個親蝦選育期間保證水溫控制在26～30℃，鹽度為28～34，溶氧保證5毫克/升以上，PH7.8～8.6，水中總氨氮含量低于0.6毫克/升。每天按照對蝦體重的2％投喂親蝦飼料(購于湛江恒興南方海洋科技有限公司)，每天投喂4次。
2)攻毒親蝦在1000L水族箱中暫養10天后，從水族箱中快速撈出對蝦，用一次性注射器在每尾親蝦背部第一附節肌肉注射WSSV病毒液50μL，然后放回到水族箱中。
所述的WSSV病毒液優選的制備方法為在爆發白斑綜合癥的養殖池塘進行取樣，該蝦池白斑綜合癥癥狀明顯，經PCR檢測和投喂感染證明為WSSV陽性。取0.1g爆發白斑綜合癥的對蝦附節肌肉放入勻漿器中，迅速加入1mLPBS緩沖液，冰浴研磨均勻，然后將病毒液置入1.5mL的EP管中3000r/min離心5min，取上清200μL加入到1800μL的PBS緩沖液中，用經高壓消毒過的裝有0.22μL孔目的過濾器過濾除菌。取濾液500μL加入到49500μL(49.5mL)pH7.4的PBS緩沖液混勻，共計50mL，4℃保存備用做病毒注射液。注射前用PBS緩沖溶液稀釋1000倍使用即可。
3)淘汰非抗性親蝦注射病毒液第2天后對蝦開始出現感染癥狀，3天后開始出現死亡。每天認真觀察對蝦感染和發病情況，發現死蝦及時撈出進行無害化處理然后丟棄掉；攻毒后養殖8天后大約80％的親蝦發病死亡，剩下的對蝦不發生感染和發病癥狀，說明其具有抗白斑綜合癥病毒(WSSV)的能力。
4)親蝦培育將成活下來的親蝦再次進行篩選，選擇體表無傷、攝食良好和活力好的親蝦移入室內親蝦培育池進行培育。親蝦培育池的規格一般為16～25平方米，水深1～1.2米，每個水泥池中放入親蝦80～200尾；培育池用水水質條件要求與親蝦暫養階段相同，換水量每天換水40％～70％。光照周期按照12h12h控制，光線強度控制在500～1000lx。將親蝦配合飼料(購于湛江恒興南方海洋科技有限公司)、沙蟲、魷魚、牛肝等按照1∶3∶1∶1的比例飼喂親蝦。每天的投喂量按照親蝦體重的2％計算，每天投喂3～4次。養殖期2～3個月，待養殖親蝦大小達50～70g時，可促使其性腺發育成熟。即可進行交配產卵等苗種生產程序。
2004年7月在國家863海洋種子工程南方基地(湛江恒興南方海洋科技有限公司)SPR種蝦繁育基地，經過對5000尾親蝦進行攻毒檢驗，共篩選具備抗WSSV能力的凡納濱對蝦親蝦1531尾，經過3個月養殖，存活率95％，交配率80％。采用人工培育的凡納濱對蝦親蝦，共生產凡納濱對蝦無節幼體2.3億多尾；凡納濱對蝦苗種6900萬尾。子一代的抗WSSV凡納濱對蝦經商業養殖場進行養殖，90天可長到10～12g，且都未有白斑綜合癥發生。在實驗室內取部分子一代抗WSSV凡納濱對蝦進行攻毒試驗，結果發現其成活率可達79％。2005年，該基地又將部分子一代抗WSSV對蝦培育成為親蝦后與其他家系對蝦雜交，生產出的子二代具有更好的抗病毒能力和生長潛能。
本發明利用現代生物學的原理，通過應激試驗篩選凡納濱對蝦親蝦中具有抗WSSV能力的個體。經過該選育過程后的親蝦繁殖其子一代，二代皆具有較強的抗WSSV的能力，適合在各種條件下進行養殖，對提高商業對蝦養殖的成功率有重要作用。
本發明提供了一種健康優質種苗繁育的新方法，其操作簡單方便、適合于大規模選育具有抗WSSV特性的凡納濱對蝦親蝦。
具體實施方式實施例11)親蝦選擇與暫養按照雌雄比1∶2的比例選擇體長為14cm、體重為35g的健康親蝦5000尾，親蝦體型大、體色正常、副肢完整、鰓部清潔。按照30尾/箱的密度將親蝦放入室內1000L的PVC水族箱內，水族箱內的用水預先經過臭氧消毒、紫外線消毒和孔徑為1μm精密過濾器處理，然后按照1L/分鐘的速度進行微流水換水，在整個親蝦選育期間保證水溫控制在26℃，鹽度為28，溶氧保證5毫克/升以上，PH7.8，水中總氨氮含量0.6毫克/升。每天按照對蝦體重的2％投喂親蝦飼料(購于湛江恒興南方海洋科技有限公司)，每天投喂4次。
2)攻毒親蝦在1000L水族箱中暫養10天后，從水族箱中快速撈出對蝦，用一次性注射器在每尾親蝦背部第一附節肌肉注射WSSV病毒液50μL，然后放回到水族箱中。
注射使用得WSSV病毒液按照如下方法制備在爆發白斑綜合癥的養殖池塘進行取樣，該蝦池白斑綜合癥癥狀明顯，經PCR檢測和投喂感染證明為WSSV陽性。取0.1g爆發白斑綜合癥的對蝦附節肌肉放入勻漿器中，迅速加入1mLPBS緩沖液，冰浴研磨均勻，然后將病毒液置入1.5mL的EP管中3000r/min離心5min，取上清200μL加入到1800μL的PBS緩沖液中，用經高壓消毒過的裝有0.22μL孔目的過濾器過濾除菌。取濾液500μL加入到49500μL(49.5mL)pH7.4的PBS緩沖液混勻，共計50mL，4℃保存備用做病毒注射液。注射前用PBS緩沖溶液稀釋1000倍后即可使用。
3)淘汰非抗性親蝦注射病毒液第2天后對蝦開始出現感染癥狀，3天后開始出現死亡。每天認真觀察對蝦感染和發病情況，發現死蝦及時撈出進行無害化處理后丟棄掉；攻毒后養殖8天后大約80％的親蝦發病后死亡，剩下的對蝦不發生感染，未見發病癥狀，說明其具有抗白斑綜合癥病毒(WSSV)的能力。
4)親蝦培育將成活下來的親蝦再次進行篩選，選擇體表無傷、攝食良好和活力好的親蝦共1531尾移入室內親蝦培育池進行培育。親蝦培育池的規格為16平方米，水深1.0米，每個水泥池中放入親蝦80尾；培育池用水水質條件要求與親蝦暫養階段相同，換水量每天換水40％。光照周期按照12h12h控制，光線強度控制在500x。將親蝦配合飼料(購于湛江恒興南方海洋科技有限公司)、沙蟲、魷魚、牛肝等按照1∶3∶1∶1的比例飼喂親蝦。每天的投喂量按照親蝦體重的2％計算，每天投喂4次。養殖2個月后，親蝦大小達60g，即可進行交配產卵等苗種生產程序。
實施例21)親蝦選擇與暫養按照雌雄比1∶2的比例選擇體長為16cm、體重為38g的健康親蝦2000尾，親蝦體型大、體色正常、副肢完整、鰓部清潔。按照40尾/箱的密度將親蝦放入室內1000L的PVC水族箱內，水族箱內的用水預先經過臭氧消毒、紫外線消毒和孔徑為5μm精密過濾器的處理，按照1L/分鐘的速度進行微流水換水，在整個親蝦選育期間保證水溫控制在28℃，鹽度為30，溶氧保證6毫克/升，PH8.0，水中總氨氮含量0.5毫克/升。每天按照對蝦體重的2％投喂親蝦飼料(購于湛江恒興南方海洋科技有限公司)，每天投喂4次。
2)攻毒親蝦在1000L水族箱中暫養10天后，從水族箱中快速撈出對蝦，用一次性注射器在每尾親蝦背部第一附節肌肉注射WSSV病毒液50μL，然后放回到水族箱中。
注射使用得WSSV病毒液按照如下方法制備在爆發白斑綜合癥的養殖池塘進行取樣，該蝦池白斑綜合癥癥狀明顯，經PCR檢測和投喂感染證明為WSSV陽性。取0.1g爆發白斑綜合癥的對蝦附節肌肉放入勻漿器中，迅速加入1mLPBS緩沖液，冰浴研磨均勻，然后將病毒液置入1.5mL的EP管中3000r/min離心5min，取上清200μL加入到1800μLPBS緩沖液，用經高壓消毒過的裝有0.22μL孔目的過濾器過濾除菌。取濾液500μL加入到49500μL(49.5mL)pH7.4的PBS緩沖液混勻，共計50mL，4℃保存備用做病毒注射液。注射前用PBS緩沖溶液稀釋1000倍使用即可。
3)淘汰非抗性親蝦注射病毒液第2天后對蝦開始出現感染癥狀，3天后開始出現死亡。每天認真觀察對蝦感染和發病情況，發現死蝦及時撈出進行無害化處理然后丟棄掉；攻毒后養殖8天后大約80％的親蝦發病后死亡，剩下的對蝦不發生感染，未見發病癥狀，說明其具有抗白斑綜合癥病毒(WSSV)的能力。
4)親蝦培育將成活下來的親蝦再次進行篩選，選擇體表無傷、攝食良好和活力好的親蝦共600尾移入室內親蝦培育池進行培育。親蝦培育池的規格為25平方米，水深1.2米，每個水泥池中放入親蝦150尾；培育池用水水質條件要求與親蝦暫養階段相同，換水量每天換水70％。光照周期按照12h12h控制，光線強度控制在800lx。將親蝦配合飼料(購于湛江恒興南方海洋科技有限公司)、沙蟲、魷魚、牛肝等按照1∶3∶1∶1的比例飼喂親蝦。每天的投喂量按照親蝦體重的2％計算，每天投喂3次。養殖3個月后，親蝦大小達50g，即可進行交配產卵等苗種生產程序。
實施例31)親蝦選擇與暫養按照雌雄比1∶2的比例選擇體長為18cm、體重為40g的健康親蝦4000尾，親蝦選擇要求體型大、體色正常、副肢完整、鰓部清潔。按照35尾/箱的密度將親蝦放入室內1000L的PVC水族箱內，水族箱內的用水預先經過臭氧消毒、紫外線消毒和孔徑為4μm精密過濾器的處理，按照1L/分鐘的速度進行微流水換水，在整個親蝦選育期間保證水溫控制在30℃，鹽度為34，溶氧保證6毫克/升，PH8.6，水中總氨氮含量0.5毫克/升。每天按照對蝦體重的2％投喂親蝦飼料(購于湛江恒興南方海洋科技有限公司)，每天投喂4次。
2)攻毒親蝦在1000L水族箱中暫養10天后，從水族箱中快速撈出對蝦，用一次性注射器在每尾親蝦背部第一附節肌肉注射WSSV病毒液50μL，然后放回到水族箱中。
注射使用得WSSV病毒液按照如下方法制備在爆發白斑綜合癥的養殖池塘進行取樣，該蝦池白斑綜合癥癥狀明顯，經PCR檢測和投喂感染證明為WSSV陽性。取0.1g爆發白斑綜合癥的對蝦附節肌肉放入勻漿器中，迅速加入1mLPBS緩沖液，冰浴研磨均勻，然后將病毒液置入1.5mL的EP管中3000r/min離心5min，取上清200μL加入到1800μL的PBS緩沖液中，用經高壓消毒過的裝有0.22μL孔目的過濾器過濾除菌。取濾液500μL加入到49500μL(49.5mL)pH7.4的PBS緩沖液混勻，共計50mL，4℃保存備用做病毒注射液。注射前用PBS緩沖溶液稀釋1000倍即可使用。
3)淘汰非抗性親蝦注射病毒液第2天后對蝦開始出現感染癥狀，3天后開始出現死亡。每天認真觀察對蝦感染和發病情況，發現死蝦及時撈出進行無害化處理后丟棄掉；攻毒后養殖8天后大約80％的親蝦發病后死亡，剩下的對蝦不發生感染，未見發病癥狀，說明其具有抗白斑綜合癥病毒(WSSV)的能力。
4)親蝦培育將成活下來的親蝦再次進行篩選，選擇體表無傷、攝食良好和活力好的親蝦共1182尾移入室內親蝦培育池進行培育。親蝦培育池的規格為25平方米，水深1.2米，每個水泥池中放入親蝦200尾；培育池用水水質條件要求與親蝦暫養階段相同，換水量每天換水60％。光照周期按照12h12h控制，光線強度控制在1000lx。將親蝦配合飼料(購于湛江恒興南方海洋科技有限公司)、沙蟲、魷魚、牛肝等按照1∶3∶1∶1的比例飼喂親蝦。每天的投喂量按照親蝦體重的2％計算，每天投喂4次。養殖2個月后，親蝦大小達70g，即可進行交配產卵等苗種生產程序。
權利要求
1.一種選育具有抗白斑綜合癥病毒特性的凡納濱對蝦親蝦的方法，其特征在于具體步驟如下1)親蝦選擇按照雌雄比1∶2的比例選擇健康親蝦進行暫養；2)攻毒在親蝦背部第一附節肌肉注射白斑綜合癥病毒液；3)淘汰經病毒注射后發病和死亡的親蝦，從中篩選出具有白斑綜合癥病毒抗性的凡納濱對蝦親蝦；4)親蝦培育將篩選出的親蝦進行培育和營養強化。
2.根據權利要求1所述的選育方法，其特征在于健康的親蝦體長為14～18cm、體重為35～40g、體型大、體色正常、副肢完整、鰓部清潔。
3.根據權利要求1所述的選育方法，其特征在于健康親蝦的暫養條件為按照30～50尾/1000L的密度養殖，用水須經過臭氧消毒、紫外線消毒和1～5μm精密過濾器的處理，按照1L/分鐘的速度進行微流水換水，水溫為26～30℃，鹽度為28～34，溶氧為5毫克/升以上，PH7.8～8.6，水中總氨氮含量為0～0.6毫克/升，每天投喂親蝦飼料4次，日投喂量為對蝦體重的2％。
4.如權利要求1所述的選育方法，其特征在于白斑綜合癥病毒液的制備方法為在爆發白斑綜合癥的養殖池塘進行取樣，該蝦池白斑綜合癥癥狀必須明顯，經PCR檢測和投喂感染證明為白斑綜合癥病毒陽性；然后取0.1g爆發白斑綜合癥的對蝦附節肌肉放入勻漿器中，迅速加入1mL PBS緩沖液，冰浴研磨均勻，然后將病毒液置入1.5mL的EP管中3000r/min離心5min，取上清200μL加入到1800μL的PBS緩沖液中，用經高壓消毒過的孔徑為0.22μL的過濾器過濾除菌；接著取濾液500μL加入到49500μL、pH7.4的PBS緩沖液混勻，4℃保存備用做病毒注射液；注射前取病毒液1mL，然后加入PBS緩沖溶液999mL后即可使用。
5.根據權利要求1所述的選育方法，其特征在于培育經篩選后的具有白斑綜合癥病毒抗性的凡納濱對蝦親蝦的方法為將成活下來的親蝦再次進行篩選，選擇體表無傷、攝食良好和活力好的親蝦放入16～25平方米，水深1～1.2米的親蝦培育池，按照80～200尾/池的密度進行培育，培育池用水須經過臭氧消毒、紫外線消毒和1～5μm精密過濾器的處理，每天換水量為40％～70％，光照周期為12h∶12h，光線強度為500～1000lx；然后將親蝦配合飼料、沙蟲、魷魚、牛肝等按照1∶3∶1∶1的比例飼喂親蝦，每天投喂3～4次，日投喂量為親蝦體重的2％，養殖期2～3個月，待養殖親蝦大小達50～70g時，即可進行交配產卵等苗種生產程序。
全文摘要
本發明涉及一種選育具有抗白斑綜合癥病毒特性的凡納濱對蝦親蝦的方法，其操作程序是1)親蝦選擇按照雌雄比1∶2的比例選擇健康親蝦進行暫養；2)攻毒在親蝦背部第一附節肌肉注射白斑綜合癥病毒液；3)淘汰經病毒注射后發病和死亡的親蝦，從而篩選出具有白斑綜合癥病毒抗性的凡納濱對蝦親蝦；4)親蝦培育將篩選出的親蝦進行培育和營養強化。本發明方法簡單、操作方便、適合于大規模選育具有抗白斑綜合癥病毒特性的凡納濱對蝦親蝦。
文檔編號A01K61/00GK1926970SQ20061012242
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月26日 優先權日2006年9月26日
發明者劉興旺, 梁海鷗, 王華朗, 馮敏毅, 趙麗梅, 程成榮, 黃智成, 李治國, 韓垂旺 申請人:廣東恒興集團有限公司