專利名稱：：西伯利亞百合脫毒試管苗鱗片高效再生鱗莖方法
技術領域：
：本發明屬生物科學中的組織培養
技術領域：
，具體涉及一種百合試管苗鱗片高效再生試管微型鱗莖技術。二、
背景技術：
百合是世界五大鮮切花之一，不僅花姿優美，色彩豐富，氣味芬芳，而且其鱗莖還具有食用和藥用價值。因此，近年來對百合的研究日趨深入和廣泛，特別是在組織培養及快速繁殖方面已走向了成熟化和工業化。西伯利亞百合"/6en'aJ屬于東方百合雜種系，是近年國內外花卉市場熱銷的百合品種之一。傳統的百合繁殖方法主要釆用常規分球、分珠芽、鱗片扦插、鱗片包埋等。采用這些方法進行繁殖，繁殖系數較小，特別是經多代繁殖以后，常造成種性退化，甚至病毒積累，影響百合的產量和品質。組織培養技術能夠迅速去除病毒和更新品種，加快繁殖速度、縮短育種周期。百合的組織培養使用最多的外植體是鱗片。百合鱗片作為外植體具有容易獲得，分化能力強，對培養基要求不高等優點，是目前百合組織培養中普遍采用的外植體。自1982年陳為民、黃濟明分別采用百合鱗片作為外植體成功誘導產生了百合的再生植林以來，國內外關于百合鱗片組織培養的報道較多，主要是通過調節激素的配比來誘導其組織分化并再生植抹，但未見研究鱗片縱切片不定芽狀微型鱗莖分化的報道。三、
發明內容本發明的目的是尋找更好的百合組織培養新材料和有針對性的組織培養新方法，使西伯利亞百合試管苗鱗片高效再生不定芽狀微型鱗莖，為該品種的組培快繁及產業化、轉基因研究等提供技術基礎。研究發現，百合鱗莖不同部位的鱗片，分化不定芽的能力有差異，從強到弱依次為外層>中層>內層。鱗片不同部位切段的不定芽分化速率和數量也存在差異，依次為鱗片基部〉中部〉上部。本發明的技術解決方案為一種西伯利亞百合脫毒試管苗鱗片高效再生鱗莖方法，其特征是該方法包括以下步驟a.將西伯利亞百合試管苗置于養鱗莖培養基上培養約1.5個月，培養溫度25土2。C，光照20001ux,光照時間12小時/天；b.選取1~1.5cm直徑的試管鱗莖，剝取外側1~3層鱗片，在無菌條件下用鋒利的刀具將鱗片縱向切為厚度l~2mm的薄片，接種于誘導培養基上誘導不定芽(微型鱗莖)的發生；培養溫度25±2°C,光照20001ux,光照時間12小時/天；培養15天后可見不定芽狀小鱗莖的發生；c.不定芽狀微型鱗莖2~3cm高時，轉接入養鱗莖培養基培養，培養溫度"±2°C,光照20001ux，光照時間12小時/天；d.鱗莖直徑達到1.5~2.Ocm時，移入24。C的冷庫中培養30~50天；e.打開瓶口在大棚中常溫煉苗3~5天，自來水洗凈根系上的培養基，移栽入珍珠巖和草炭土比例為1:3的移栽基質中自然生長育苗。18天后可見地上莖抽出地面。才直;f朱生長健壯，且整齊一致。上述方法中養鱗莖廣俗稱#承，措在逸歡裙#務伴7"，炎微型舉JV^/、舉,J:逸iS遽潛義^潛#《在。^#，_￡徑AJc/b以7"定乂^參差，。.J"^定乂^W、舉JV培養基配方為MS培養基添加蔗糖80100g/L。附MSi咅養基(MurashingandSkoogmedium)才示;焦酉己方NH4N031650mg/1KN。3l卯0mg/1CaCl2■2H20440mg/1MgS047H20370mg/1KH2P04170mg/1KI0.83mg/1H3B036.2mg/1MnS04-H2016.9mg/1ZnS047H208.6mg/1Na2Mo042H200.25mg/1CuS045H200,025mg/1CoCl2■6H200.025mg/1FeS047H2027.8mg/1Na2-EDTA37,3mg/1肌醇100mg/1煙酸0.5mg/1鹽酸硫胺素0.1mg/1鹽酸吡眵醇0.5mg/1甘氨酸2mg/1謙導培養基為:MS+2,4-D0.5mg/L+TDZ0.006mg/L+蔗糖30g/L;在步驟(c)中，不定芽狀微型鱗莖首次轉接入養鱗莖培養基時，應在無菌條件下剪去上部約2/3的葉片，第二次養鱗莖時在無菌條件下，將完整小鱗莖取出，切除周圍雜亂組織和葉片，接種到養鱗莖培養基。本發明與現有技術相比，其顯著優點是極大的提高了試管鱗片的再生微型鱗莖的效率和繁殖系數，為快速繁殖百合試管微型鱗莖和轉基因研究提供了技術基礎。四圖1剝取鱗片的鱗莖；圖2接種在誘導培養基上的鱗片縱向切片；圖3鱗片縱向的分化效果；圖4箭頭所指處為養鱗莖之前的不定芽狀微型鱗莖；圖5進入冷庫的試管鱗莖；圖6TDZ不濃度對鱗片縱切片分化不定芽狀微型鱗莖的影響曲線。五具體實施方式實施例1:選取1~1.5cm直徑的試管鱗莖，剝取外側1~3層鱗片，在無菌條件下用鋒利的刀具將鱗片縱向切為厚度1~2隱的薄片，每個鱗片平均可得到6~8片鱗片縱切片，切片形狀參見附圖2。實施例2:誘導培養基中，2,4-D添加濃度對鱗片縱切片分化不定芽狀微型鱗莖的影響見表l。表l2，4-D濃度對鱗片縱切片分化不定芽狀微型鱗莖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>鱗片縱切片接種于誘導培養基上五天開始逐漸轉綠。十天可見基部有芽點出現，近軸面與遠軸面表皮輕微愈傷化。十二天時輕微愈傷化的表皮有出現芽點，十五天形成完整不定芽狀微型鱗莖。表1說明TDZ用量在0.005mg/L時隨2,4-D用量加大平均不定芽狀微型鱗莖數增加，在0.5mg/L時最大，隨后逐漸降低。不定芽狀微型鱗莖發生頻率與2,4-D用量沒有太大關聯。確定0.5mg/L2,4-D為鱗片縱切片不定芽狀微型鱗莖誘導的最佳用量。實施例3:誘導培養基中，TDZ不同濃度對鱗片縱切片分化不定芽狀^t型鱗莖的影響見表2和附圖6。表2TDZ不濃度對鱗片縱切片分化不定芽狀微型鱗莖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>0.0025043868.243540.00450501006.53250.0055045卯73150.006505010084000細50501007.53750.0150501006.743370.055042844.6193對TDZ使用濃度測試表明在TDZ用量為0.002mg/L時平均不定芽狀微型鱗莖數達到最高，但總不定芽狀微型鱗莖數量少，發生頻率降低。TDZ用量為0.006mg/L時雖然平均不定芽狀微型鱗莖數略低于0.002mg/L,但是不定芽狀微型鱗莖總數高于0.002mg/L,發生頻率可以達到100°/。。所以確定0.006mg/LTDZ為鱗片縱切片不定芽狀微型鱗莖誘導的最佳用量。采用本發明提供的的方法，極大的提高了試管鱗片的再生微型鱗莖的效率和繁殖系數，為快速繁殖百合試管微型鱗莖和轉基因研究提供了技術基礎。權利要求1.一種西伯利亞百合脫毒試管苗鱗片高效再生鱗莖方法，其特征是該方法包括以下步驟a.將西伯利亞百合試管苗置于養鱗莖培養基上培養約1.5個月，培養溫度25±2℃，光照2000lux，光照時間12小時/天；b.選取1～1.5cm直徑的試管鱗莖，剝取外側1～3層鱗片，在無菌條件下用鋒利的刀具將鱗片縱向切為厚度1～2mm的薄片，接種于誘導培養基上誘導不定芽狀微型鱗莖發生；培養溫度25±2℃，光照2000lux，光照時間12小時/天；c.不定芽狀微型鱗莖葉片2～3cm高時，轉接入養鱗莖培養基培養，培養溫度25±2℃，光照2000lux，光照時間12小時/天；d.鱗莖直徑達到1.5～2.0cm時，移入2～4℃的冷庫中培養30～50天；e.打開瓶口在大棚中常溫煉苗3～5天，自來水洗凈根系上的培養基，移栽入珍珠巖和草炭土比例為1∶3的移栽基質中自然生長育苗。2.如權利要求l所述的西伯利亞百合脫毒試管苗鱗片高效再生鱗莖方法，其特征是誘導培養基的最佳配方為MS+2,4-D0.5mg/L+TDZ0.006mg/L+蔗糖30g/L。全文摘要一種西伯利亞百合脫毒試管苗鱗片高效再生鱗莖方法，其特征是選取1～1.5cm直徑的試管鱗莖，剝取外側1～3層鱗片，在無菌條件下用鋒利的刀具將鱗片縱向切為厚度1～2mm的薄片，接種于誘導培養基上誘導不定芽的發生。當不定芽長到2～3cm高時再轉入養鱗莖培養基培養，當鱗莖直徑達到1.5～2.0cm時，分別進行冷庫培養、常溫煉苗后即可移栽入珍珠巖和草炭土基質中進行常規育苗。文檔編號A01H4/00GK101133717SQ20071013082公開日2008年3月5日申請日期2007年8月22日優先權日2007年8月22日發明者席夢利,施季森,王鵬凱,胡鳳榮申請人:南京林業大學