專利名稱：一種新西伯利亞銀白楊的微繁方法
技術領域：
本發明涉及一種微繁方法。
背景技術：
新西伯利亞銀白楊(尸Zwc/zo/em7 xp ;^ra柳Vfo/^ ROZ)原產俄羅斯，是經過 俄羅斯幾代科學家的艱苦努力培育而成的、極耐高寒、高溫的優質速生樹種， 而且具有優良的觀賞性和較強的耐鹽堿和耐旱能力，一般十幾年內即可成材利 用，是制造紙槳和膠合板的良好原料，同時也是用于生態建設，環境保護等方 面的重要樹種之一。
新西伯利亞銀白楊于2004年由俄羅斯西伯利亞引進我國，引進時為數量 有限的嫩枝莖端，經過扦插繁殖得到的苗木在黑河地區可以安全越冬，無任何 凍害發生，結束了我國北方城市沒有高緯寒地耐寒速生楊樹品種的歷史，具有 很大的發展空間。黑河地區已經計劃在短期內(2010年前)培育出優質速生楊樹 苗木100萬株，用于高產高效人工林基地建設，但是由于引進的嫩莖數量有限， 且扦插繁殖新西伯利亞銀白楊的周期長，至少需要6個月，增殖效率低，成本 高，遠遠不能滿足市場的需要，這使新西伯利亞銀白楊在我國境內的推廣栽培 和資源利用受到了極大的限制。目前，有利用楊樹葉片誘導產生不定芽的繁殖 技術，但是存在產生的后代變異大，遺傳穩定性差的問題。
發明內容
本發明的目的是為了解決新西伯利亞銀白楊繁殖周期長、增殖效率低、成 本高和遺傳穩定性差的問題，而提供的一種新西伯利亞銀白楊的微繁方法。
新西伯利亞銀白楊的微繁方法按以下步驟實現 一、將清洗后的新西伯利
亞銀白楊外植體在超凈工作臺上用質量濃度為75。/。的乙醇溶液浸泡60s后再用 另一份質量濃度為75%的乙醇溶液浸泡60s,然后用無菌水沖洗3 5次，再 用質量濃度為0.1%的氯化汞溶液消毒12 15min，然后用無菌水沖洗3 5次； 二、將消毒后的外植體切割成帶有1個頂芽或1 2個腋芽、且長度為1 2cm 的莖段，然后接種于誘導培養基中，在溫度為25 28"C、濕度為70% 80%、光照強度為40 6(Vmol'cm《s—、每天光照16 18h的條件下培養至無菌芽生 長長度為0.5 lcm;三、將外植體連同增生的無菌芽一起轉接于繼代培養基 中，在溫度為25 28°C、濕度為70% 80%、光照強度為40 60^imobcm—2's"、 每天光照16 18h的條件下培養至無菌芽生長長度為2 5cm，即為微枝(無根 試管苗)；四、將每個微枝從莖段上單獨切離，然后接種于增壯培養基中，在 溫度為25 28。C、濕度為70% 80%、光照強度為^-GO^imoHm^'s^每天 光照16 18h的條件下培養至微枝生長長度為4 6cm;五、將增壯后的微枝 切割成帶有1個頂芽或1 2個腋芽、且長度為1 2cm的莖段，然后逐段接 種于增殖培養基中培養至微枝生長長度為4 6cm，再扦插于生根基質中進行 生根培養后即完成新西伯利亞銀白楊的微繁；其中步驟二中誘導培養基是以改 良MS固體培養基為基本培養基，且還包含0.5 1.0mg/L的6-芐基氨基嘌呤 (6-BA)、 0.05 0.1mg/L的奈乙酸(NAA)和質量濃度為2.5 3.0%的蔗糖，pH 值為5.6 6.0;步驟三中繼代培養基是以改良MS固培養基為基本培養基，且 還包含0.1 0.3mg/L的6-芐基氨基嘌呤(6-BA)、0.05 0.1mg/L的奈乙酸(NAA) 和質量濃度為2.0 2.5%的蔗糖，pH值為5.6 6.0;步驟四中增壯培養基是以 MS固培養基為基本培養基，且還包含質量濃度為2.0 2.5%的蔗糖，pH值為 5.6 6.0;步驟五中增殖培養基是以改良MS固培養基為基本培養基，且還包 含0.1 0.3mg/L的6-芐基氨基嘌呤(6-BA)、 0.05 0.1mg/L的奈乙酸(NAA)和 質量濃度為2.0 2.5%的蔗糖，pH值為5.6 6.0;步驟五中生根基質按體積比 由25%的草炭土、 30%的蛭石和45%的珍珠巖組成，生根基質含水量為50% 60%。
本發明中新西伯利亞銀白楊的微繁，繁殖周期短，效率高，其增殖效率可 達30倍，而且利用母株上原有的頂芽或腋芽直接進行芽的增殖，所產生的后 代遺傳穩定性好；增殖培養后的微枝在試管外不需要任何化學試劑和植物激素 可直接生根成完整的再生植株，生根和馴化同時進行，省工省時，成本低，且 生根率和移苗成活率均可達100%，實現了新西伯利亞銀白楊的快速、高效繁 殖及大規模推廣種植的目標。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式新西伯利亞銀白楊的微繁方法按以下步驟實現 一、將清洗后的新西伯利亞銀白楊外植體在超凈工作臺上用質量濃度為
75%的乙醇溶液浸泡60s后再用另一份質量濃度為75%的乙醇溶液浸泡60s， 然后用無菌水沖洗3 5次，再用質量濃度為0.1%的氯化汞溶液消毒12 15min，然后用無菌水沖洗3 5次；二、將消毒后的外植體切割成帶有1個頂 芽或1 2個腋芽、且長度為1 2cm的莖段，然后接種于誘導培養基中，在 溫度為25 28。C、濕度為70% 80%、光照強度為^-GO^imol'cm-^s^每天 光照16 18h的條件下培養至無菌芽生長長度為0.5 lcm;三、將外植體連 同增生的無菌芽一起轉接于繼代培養基中，在溫度為25 28"C、濕度為70% 80%、光照強度為40 60^imolxn^'s'1、每天光照16 18h的條件下培養至無 菌芽生長長度為2 5cm，即為微枝(無根試管苗)；四、將每個微枝從莖段上 單獨切離，然后接種于增壯培養基中，在溫度為25 28°C、濕度為70% 80%、 光照強度為40 60^imoLcm、'1、每天光照16 18h的條件下培養至微枝生長 長度為4 6cm;五、將增壯后的微枝切割成帶有1個頂芽或1 2個腋芽、且 長度為1 2cm的莖段，然后逐段接種于增殖培養基中培養至微枝生長長度為 4 6cm，再扦插于生根基質中進行生根培養后即完成新西伯利亞銀白楊的微 繁；其中步驟二中誘導培養基是以改良MS固體培養基為基本培養基，且還包 含0.5 1.0mg/L的6-芐基氨基嘌呤(6-BA)、 0.05 0.1mg/L的奈乙酸(NAA)和 質量濃度為2.5 3.0%的蔗糖，pH值為5.6 6.0;步驟三中繼代培養基是以改 良MS固培養基為基本培養基，且還包含0.1 0.3mg/L的6-節基氨基嘌呤 (6-BA)、 0.05 0.1mg/L的奈乙酸(NAA)和質量濃度為2.0 2.5%的蔗糖，pH 值為5.6 6.0;步驟四中增壯培養基是以MS固培養基為基本培養基，且還包 含質量濃度為2.0 2.5%的蔗糖，pH值為5.6 6.0;步驟五中增殖培養基是以 改良MS固培養基為基本培養基，且還包含0.1 0.3mg/L的6-芐基氨基嘌呤 (6-BA)、 0.05 0.1mg/L的奈乙酸(NAA)和質量濃度為2.0 2.5%的蔗糖，pH 值為5.6 6.0;步驟五中生根基質按體積比由25%的草炭土、30%的蛭石和45% 的珍珠巖組成，生根基質含水量為50% 60%。
本實施方式從新西伯利亞銀白楊幼樹中選定速生、耐寒、抗逆性、觀賞性 表現好的健康單株作為采集外植體的母株。
本實施方式采集休眠芽飽滿的幼嫩的枝條作為外植體。
6本實施方式步驟一中清洗是用清水洗凈外植體(水中可加入一滴洗滌劑)， 清洗時用細毛刷輕輕刷洗枝條表面的灰塵和雜菌，注意不要損傷休眠芽，然后
將枝條在自來水下沖洗0.5 lh。
本實施方式步驟二中莖段接種于誘導培養基，是保持莖段形態學上端向上 的方式將莖段垂直插入誘導培養基中，深度為0.5cm。
本實施方式步驟五中將增壯后的微枝切割成莖段后逐段接種于增殖培養 基，是將具頂芽的莖段垂直插入到增殖培養基中，深度為0.5cm;將具腋芽的 莖段平放在增殖培養基表面。
本實施方式步驟五中每30天左右將增殖培養中的培養物(不切割)轉接一 次，轉接到新鮮的增殖培養基上，無菌芽生長為微枝， 一般轉接一次即可實現 新微枝的形成，增殖倍數可達30。
本實施方式中步驟四和步驟五可循環進行，直至產生能夠滿足需求的微枝
、i^曰數量。
本實施方式步驟五中生根培養室溫度為25 28°C，濕度為70% 80%， 每天光照16 18h，光照強度為AO-GO^imol'cmAs^
本實施方式步驟五中生根培養可與馴化培養同時進行，是將微枝周圍的生 根基質壓實并在生根基質表面和微枝葉面上略噴水，然后覆上保鮮膜在培養室 內培養；每天以噴灑的方式澆水2次，每天早晚揭膜2 5min通風換氣，20 天后去掉保鮮膜，培養7 10天時微枝可生根，生根率達100%。
本實施方式中新西伯利亞銀白楊的微繁完成后，可進行苗木移栽和大田定 植，即為生根后的微枝繼續培養30天，然后移栽到塑料小缽中(小缽中的培養 基質為草炭土和沙土的混合物)，放到溫室或大棚中進行培養，注意保持溫室 和大棚內良好的通風，移苗成活率達100%;待苗高15 40厘米時可供大田中 生產定植。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同是步驟一中用無菌 水沖洗3次，再用質量濃度為0.1%的氯化汞溶液消毒13min，然后用無菌水 沖洗3次。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
本實施方式中氯化汞溶液可加入一滴吐溫-20 。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
二的不同是步驟二中外植體切割成帶有1個頂芽或2個腋芽、且長度為1.5cm的莖段。其它步驟及參數與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
三的不同是步驟二中在溫度 為25。C、濕度為75%、光照強度為50|111101《11^5-1、每天光照17h的條件下培 養至無菌芽生長長度為lcm。其它步驟及參數與具體實施方式
三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
四的不同是步驟三中在溫度 為27'C、濕度為70%、光照強度為55jimol'cm^s"、每天光照17h的條件下培 養至無菌芽生長長度為4cm。其它步驟及參數與具體實施方式
四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
五的不同是步驟四中在溫度 為27'C、濕度為80%、光照強度為50^imokm^s"、每天光照17h的條件下培 養至微枝生長長度為5cm。其它步驟及參數與具體實施方式
五相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
六的不同是步驟五中將增壯 后的微枝切割成帶有1個頂芽或2個腋芽、且長度為1.5cm的莖段，然后逐段 接種于增殖培養基中培養至微枝生長長度為5cm。其它步驟及參數與具體實施 方式六相同。
權利要求
1、一種新西伯利亞銀白楊的微繁方法，其特征在于新西伯利亞銀白楊的微繁方法按以下步驟實現一、將清洗后的新西伯利亞銀白楊外植體在超凈工作臺上用質量濃度為75％的乙醇溶液浸泡60s后再用另一份質量濃度為75％的乙醇溶液浸泡60s，然后用無菌水沖洗3～5次，再用質量濃度為0.1％的氯化汞溶液消毒12～15min，然后用無菌水沖洗3～5次；二、將消毒后的外植體切割成帶有1個頂芽或1～2個腋芽、且長度為1～2cm的莖段，然后接種于誘導培養基中，在溫度為25～28℃、濕度為70％～80％、光照強度為40～60μmol·cm-2·s-1、每天光照16～18h的條件下培養至無菌芽生長長度為0.5～1cm；三、將外植體連同增生的無菌芽一起轉接于繼代培養基中，在溫度為25～28℃、濕度為70％～80％、光照強度為40～60μmol·cm-2·s-1、每天光照16～18h的條件下培養至無菌芽生長長度為2～5cm，即為微枝；四、將每個微枝從莖段上單獨切離，然后接種于增壯培養基中，在溫度為25～28℃、濕度為70％～80％、光照強度為40～60μmol·cm-2·s-1、每天光照16～18h的條件下培養至微枝生長長度為4～6cm；五、將增壯后的微枝切割成帶有1個頂芽或1～2個腋芽、且長度為1～2cm的莖段，然后逐段接種于增殖培養基中培養至微枝生長長度為4～6cm，再扦插于生根基質中進行生根培養后即完成新西伯利亞銀白楊的微繁；其中步驟二中誘導培養基是以改良MS固體培養基為基本培養基，且還包含0.5～1.0mg/L的6-芐基氨基嘌呤、0.05～0.1mg/L的奈乙酸和質量濃度為2.5～3.0％的蔗糖，pH值為5.6～6.0；步驟三中繼代培養基是以改良MS固培養基為基本培養基，且還包含0.1～0.3mg/L的6-芐基氨基嘌呤、0.05～0.1mg/L的奈乙酸和質量濃度為2.0～2.5％的蔗糖，pH值為5.6～6.0；步驟四中增壯培養基是以MS固培養基為基本培養基，且還包含質量濃度為2.0～2.5％的蔗糖，pH值為5.6～6.0；步驟五中增殖培養基是以改良MS固培養基為基本培養基，且還包含0.1～0.3mg/L的6-芐基氨基嘌呤、0.05～0.1mg/L的奈乙酸和質量濃度為2.0～2.5％的蔗糖，pH值為5.6～6.0；步驟五中生根基質按體積比由25％的草炭土、30％的蛭石和45％的珍珠巖組成，生根基質含水量為50％～60％。
2、 根據權利要求1所述的一種新西伯利亞銀白楊的微繁方法，其特征在于步驟一中用無菌水沖洗3次，再用質量濃度為0.1%的氯化汞溶液消毒 13min，然后用無菌水沖洗3次。
3、 根據權利要求2所述的一種新西伯利亞銀白楊的微繁方法，其特征在 于步驟二中外植體切割成帶有1個頂芽或2個腋芽、且長度為1.5cm的莖段。
4、 根據權利要求3所述的一種新西伯利亞銀白楊的微繁方法，其特征在 于步驟二中在溫度為25t:、濕度為75%、光照強度為5(^moLcm-、"、每天光 照17h的條件下培養至無菌芽生長長度為lcm。
5、 根據權利要求4所述的一種新西伯利亞銀白楊的微繁方法，其特征在 于步驟三中在溫度為27。C、濕度為70%、光照強度為55pmol.cm-、"、每天光 照17h的條件下培養至無菌芽生長長度為4cm。
6、 根據權利要求5所述的一種新西伯利亞銀白楊的微繁方法，其特征在 于步驟四中在溫度為27'C、濕度為80%、光照強度為5(^mol，cm、"、每天光 照17h的條件下培養至微枝生長長度為5cm。
7、 根據權利要求6所述的一種新西伯利亞銀白楊的微繁方法，其特征在 于步驟五中將增壯后的微枝切割成帶有1個頂芽或2個腋芽、且長度為L5cm 的莖段，然后逐段接種于增殖培養基中培養至微枝生長長度為5cm。
全文摘要
一種新西伯利亞銀白楊的微繁方法，它涉及一種微繁方法。它解決了新西伯利亞銀白楊繁殖周期長、增殖效率低和成本高的問題。方法1.外植體的消毒；2.將外植體切割成莖段，然后誘導培養；3.將外植體同連增生的無菌芽一起轉接于繼代培養基中，繼代培養為微枝；4.將每個微枝從莖段上單獨切離，然后進行增壯培養；5.將增壯后的微枝切割成莖段，然后進行增殖培養，再扦插于生根基質中進行生根培養后即完成新西伯利亞銀白楊的微繁。本發明中新西伯利亞銀白楊的微繁，繁殖周期短，效率高，遺傳穩定性好，其增殖效率可達30倍，成本低，且生根率和移苗成活率均可達100％。
文檔編號C12N5/04GK101502238SQ20091007134
公開日2009年8月12日 申請日期2009年1月24日 優先權日2009年1月24日
發明者玲 楊, 沈海龍 申請人:東北林業大學;沈海龍;楊 玲