專利名稱：：一種抗根癌病櫻桃砧木苗的選育方法及組培快繁技術的制作方法
技術領域：
：本發明屬于農業中的果樹繁殖和選育方法，具體涉及一種采用組培快繁技術快速篩選和繁殖生產抗根癌病櫻桃砧木苗的方法。背景纟支術目前我國甜櫻桃分布主要集中在渤海灣沿岸，以煙臺市和大連市郊區為最多。山東省是我國甜櫻桃栽培面積最大、產量最多的一個省，除煙臺市各區縣外，青島、威海、濟南、日照、淄博、濰坊、棗莊、泰安、臨圻等地也有分布。遼寧省集中分布在大連市的金州區和甘井子區。河北省主要分布在秦皇島市山海關區，北戴河區及昌黎縣。此外，北京、河南、山西、映西、內蒙古、新疆、湖北、江西、四川等十幾個省、自治區、直轄市也都有引種和栽培。近幾年由于人民生活水平的提高、甜櫻桃作為觀光休閑農業不斷發展。櫻桃扦插不易生根，生產上都采用嫁接繁殖櫻桃苗木，嫁接苗包括砧木和*接穗品種兩個部分。由于砧木對地上部分的生長、結果以及本身的抗病性有很大影響，因此選育合適的砧木非常重要。生產上常用的櫻桃砧木根癌病發病率高，造成樹勢弱，結果品質差，大樹易死亡，給果農造成了很大的經濟損失。在一定程度上也限制了櫻桃這一產業的發展速度。為此，選擇抗根癌病的櫻桃砧木，對調整農業種植結構、促進觀光休閑農業的發展、櫻桃老果園的更新換代和新果園的建立都有重要的意義。花卉、果樹和林木的組培快繁技術是北京市海淀區植物組織培養技術實驗室20多年來重點研究的一套應用于生產中并產生較好效果和較大經濟效益的生物技術之一。該技術的主要要點是將在田間生長的植物體的一部分組織或器官，在超凈工作臺上進行消毒、接種，通過在培養室中培養誘導其分化、促使其增殖生長和生根，最后經過移栽過渡形成一個正常的植抹。這一生物技術應用于花卉、果樹和林木的快速繁殖，在國家外專局、市科委、市財政局、海淀區科委和農林委等10多個項目中得到應用(其中有兩個項目獲得北京市科技進步三等獎，兩個獲得國家發明專利)。我們在組培快繁工作中，所確定的接種材料通常是綜合性狀優良，材料本身資源少、用常規方法繁殖慢或繁殖困難的植物。因此，需要通過組培快繁技術體系的建立獲得大量的組培苗用于研究、生產、應用和推廣。
發明內容本發明公開了一種利用植物組織培養技術進行抗根癌病櫻桃砧木快速篩選和繁殖的方法。本發明所公開的方法包括櫻桃砧木的組培快繁過程和抗根癌病櫻桃砧木的快速篩選過程，以下對櫻桃砧木的組培快繁過程和抗根癌病櫻桃砧木的快速篩選過程分別進行詳細的說明。一、櫻桃砧木的組培快繁過程包括外植體的選擇、擴繁培養、壯苗培養、生根培養和組培苗移栽方法等在內的櫻桃砧木組培快繁技術，具體的過程步驟如下1、外植體即抗根癌病櫻桃砧木試管苗的選擇一般來說，多年生的木本植物相對帶菌多，在組培快繁過程中外植體污染率較高。因此，降低外植體污染率，是木本植物組培快繁技術需要解決的關鍵問題之一。由于不同時期外植體污染情況存在很大差異，在試驗過程中，選擇休眠的枝條、早春休眠枝水培萌發的新梢、生長季新梢等不同時期的外植體材料進行接種，在消毒方法相同的條件下，接種兩個星期后統計污染率。統計結果如表l。表1不同時期的外植體材料污染情況比較取材時期休眠枝水培新梢生長季新梢污染率(％)10018.892.9從表1可以看出，不同時期的外植體材料接種時污染率差異顯著，這是由于不同生長時期的枝條本身帶菌量不同和對消毒劑的敏感性不同所至。休眠期的枝條帶菌量大，木質化程度高，消毒劑不易滲透，因此，外植體的污染率就高；休眠枝水培條件下萌發的新梢處于旺盛生長時期，枝條本身和外界環境帶菌量相對較少，枝條木質化程度低，消毒劑易于滲透，消毒效果好，所以外植體污染率低；由于生長季多為雨季，細菌繁殖快，外植體和周圍環境中菌類含量會有所增高，這也是處于生長季的新捎外植體污染率較高的原因。利用櫻桃砧木種子、(易發生敗育種子的)未成熟胚和枝條作為外植體進行接種，接種時期為種子在沙藏后30天-60天，其中所述的未成熟胚為受精后胚敗育前獲得的未成熟胚，所述的枝條為早春水培新梢或溫室苗的新梢，當新梢長到IO公分左右時，剪取新梢用于組培快繁的外植體材料。此時的外植體由于帶菌量少、褐化輕，易于獲得無菌試管苗；對所得的無菌試管苗進行抗才艮癌病篩選，選取癭瘤的重量分級為0級的抗根癌病櫻桃砧木試管苗，其步驟如下將無菌櫻桃砧木試管苗莖中下部接種農桿菌后，置于無激素的MS培養基中進行培養，40天后統計病發率即把癭瘤從發病部位取下并稱重，其中抗根癌病櫻桃砧木試管苗的抗性強弱以結瘤百分率和癭瘤重量表示如下結瘤百分率(％)=結瘤的植抹數/接瘤的植株數按癭瘤的重量分級0級、無瘤產生；1級、瘤體重量^10mg(以不大于植抹直徑的癭瘤的重量為標準)；2級、瘤體重量10mg以上(癭瘤大于莖的直徑，影響植4朱生長的均為2級)。病情指數(％)=S(受害級值x每級株數)/(最高級值x總林數)xlOO;上述接種的過程如下a、材料要檢測的櫻桃砧木試管苗或組培生根苗(以吉賽拉為對照);b、病原菌及懸浮液的制備把農桿菌(胭脂堿型農桿菌C58)在固體培養基YEB上劃線培養，于4。C保存，接種前挑取C58單菌落接種于YEB的液體培養基中，27。C振蕩培養，OD禱值達O.5,用于活體接瘤實驗；c、接種與培養用無菌注射器蘸取農桿菌菌液，在櫻桃砧木試管苗莖中下部用無菌注射器接種農桿菌，接種后的試管苗培養于無激素的MS培養基中，組培生根苗栽植于花盆中，每個品種接30抹以上；2、擴繁培養經由步驟(1)對外植體的選擇，獲得無菌試管苗后，當小試管苗長到lcm以上時，切下小苗并將其轉移到擴繁培養基MS+6BA0.5-2.Omg/L(即在基本培養基的組成上加入1.0mg/L激素6BA配成的培養基)上，溫度控制在2(TC-24。C左右，光強1500Lx-2500Lx，光照12小時，促使櫻桃砧木試管苗增殖，采用上述擴繁培養基和培養條件，能使櫻桃砧木試管苗的分化率達到100%,月增殖倍數達到6.6,并且生長良好，可以滿足大規模生產的需求；本發明申請人對櫻桃砧木試管苗的增殖進行了不同基本培養基、不同激素、不同培養條件等方面的試驗來確定最佳的實施條件2.1基本培養基對試管苗增殖的影響為了篩選適宜櫻桃砧木試管苗生長和分化的培養基，首先選擇了MS、AS、NTH、MILLER、WHITE、WP等基本培養基進行了試驗。試驗結果證明在其它條件相同的情況下，櫻桃砧木試管苗在MS培養基上增殖和生長情況較好，月增殖倍數較高(見表2),且試管苗葉色濃綠、生長健壯。因此，MS培養基是適宜櫻桃砧木試管苗增殖和生長的培養基類型。表2基本培養基對櫻桃砧木試管苗增殖的影響培養基MSAS訓MILLERWHITEWP月增殖倍數3,22.82.41.91.62.12.2細胞分裂素對試管苗增殖的影響選用6BA和KT兩種細胞分裂素，濃度為0.5、1.0、2.0、4.0mg/L，以不加細胞分裂素的培養基為對照，試驗結果見表3。表3不同細胞分裂素對櫻桃砧木試管苗增殖的影響細胞分裂素6BAKTCK(mg/L)0.51.02.04.00.51.02.04.0月增殖倍數4.76.65.83.20.60.81.43.60.6從表3可以看出，6BA對櫻桃砧木試管苗增殖的促進作用好于KT，其中6BA濃度為1.0mg/L時，櫻桃砧木試管苗的月增殖倍數最高達到6.6。2.3溫度對試管苗增殖的影響在其它條件相同的情況下，把櫻桃砧木試管苗放在22±2。C和25土2。C兩種溫度下培養。表4的試驗統計結果表明在25土2。C的培養室內，櫻桃砧木試管苗的增殖倍數比22士2。C時有所提高，但試管苗較細弱、易發生玻璃化；在22土2。C的溫度條件下培養，櫻桃砧木試管苗生長健壯、生長情況良好。表4溫度對櫻桃砧木試管苗增殖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3、壯苗培養:在步驟(2)中由于有些櫻桃砧木試管苗節間較短，不能很好地拔高生長，造成成苗率低，給試管苗的生根和移栽帶來很大困難。因此，當櫻桃砧木試管苗增殖到一定數量后，需要對步驟(2)擴繁后的試管苗進行壯苗培養，所采用的壯苗培養基為MS+GA5-10mg/L,壯苗時間以一個月左右為宜，否則會造成櫻才兆組培苗細弱、黃^:和脫葉；為了獲取壯苗培養的最佳條件，本發明進行了影響抗根癌病櫻桃砧木試管苗成苗率的試驗。試驗中發現，培養溫度的改變、培養基中加入活性炭等物質，對櫻桃砧木試管苗的成苗率影響不大；GA對促進櫻桃砧木試管苗的生長具有重要的作用。選用GA5、10、20mg/L三種不同的濃度進行試驗，以不加GA的培養基為對照，試驗結果如表5。表5不同因素對櫻桃砧木試管苗成苗率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注成苗率=1.5cm以上苗數/總苗數從表5可以看出，隨著GA濃度的增加，成苗率有所增加；但同時也發現，隨著GA濃度和培養時間的增加，櫻桃砧木試管苗黃化現象明顯，莖尖會出現褐化死亡，還會降低櫻桃砧木試管苗的生根率。在實際應用中較適宜的GA濃度是5-10mg/L,培養時間以一個月左右為宜。4、生根培養..經過步驟(3)壯苗培養后的櫻桃砧木試管苗，轉接到MS+IBA1.Omg/L或MS+MA0.5mg/L的生根培養基中，促使櫻桃砧木試管苗的生根，采用上述的生根培養基，其生根率能達到93.7%;本發明對影響抗根病櫻桃砧木苗的生根因素進行了試驗，內容如下櫻桃砧木試管苗生根的影響因素很多，重點對不同抹系、生長素、培養基中蔗糖和活性炭的含量、苗的剪切部位以及插苗方式等進行了試驗研究。4.1不同株系櫻桃砧木試管苗生根率的差異在試驗中發現，在沒有激素作用的情況下，不同林系櫻桃砧木試管苗的生根率存在很大差異(見表6),這可能是不同抹系的基因型不同所致。_表6不同抹系櫻桃砧木試管苗的生根率_<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>生根率(％)10087.58049.74.2生長素對櫻桃砧木試管苗生根的影響選生根率相對較低的櫻桃砧木林系試管苗進行生根試驗，試驗結果見表7。試一驗結果證明生長素IBA(1.0mg/L)和NAA(0.5mg/L)對櫻桃砧木試管苗生根均有較好的促進作用，使生根率達到93%以上。表7生長素對櫻桃砧木試管苗生^f艮的影響生長素(mg/L)0IBAO.5IBA1.0NAAO.1NAAO.5生根率(％)55.683.193.779.793.74.3蔗糖和活性炭對櫻桃砧木試管苗生根的影響進行蔗糖(濃度為20g/L和30g/L)和活性炭(加活性炭0.25%和不加活性炭)對試管苗生根影響的試驗結果表明蔗糖對櫻桃砧木試管苗的生根有促進作用；而活性炭對櫻桃砧木試管苗的生根表現出雙重作用，在沒有生長素的情況下活性炭可以促進櫻桃砧木試管苗的生根，在生長素存在的情況下活性炭對櫻桃砧木試管苗的生根有抑制作用(見表8)。這種情況出現的原因可能是在無生長素存在的條件下，活性炭吸附了一些抑制生根的因子，從而促進了根的發生；而在生長素存在的條件下，活性炭對生長素的吸附作用較大，降低了生長素對生根的促進作用，與不加活性炭相比使生根率有所下降。表8活性炭(AC)對櫻桃砧木試管苗生根的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4.4苗的剪切部位和扦插深度對櫻桃砧木試管苗生根的影響把櫻桃砧木試管苗的剪切部位分為兩種一種是在節間剪，另一種是在節處剪(貼著葉下)；另外，把扦插的方式也分為兩種淺插(不超過1/2培養基深度)和深插(超過1/2培養基深度)。試驗結果證明貼著葉下剪切櫻桃砧木試管苗的生根率相對較高，這可能是由于節處的細胞相對活躍、分生力強、對激素作用敏感的緣故；而苗的扦插方式對櫻桃砧木試管苗的生根率影響不大，但是，淺插更有利于櫻桃砧木試管苗根的生長。5、組培苗移栽當櫻桃砧木試管苗生根后，從培養容器中取出，洗凈瓊脂，進行移栽過渡，過渡苗一般用容器加基質進行栽培，櫻桃砧木試管苗移栽過渡的基質為蛭石，櫻桃砧木試管苗在此基質中移栽過渡的成活率最高可以達到95%以上，移栽過渡成活后的櫻桃砧木苗根據情況可以進行容器栽植或田間定植。為了提高櫻桃砧木試管生根苗的移栽成活率，對試管生根苗的狀態、移栽基質等方面進行了試驗研究。5.1試管生根苗的狀態對移栽成活的影響根據試管生根苗根發育的不同時期把苗分為根原基、短根(根長1CM以下)和長根(根長1CM以上)三種情況，并把三種類型的櫻桃砧木試管苗分別移栽在相同的條件下。一個月后統計試驗結果表明三種情況櫻桃砧木試管生根苗的移栽成活率相差不顯著。5.2基質對試管生根苗移栽成活的影響以沙子、蛭石、營養土、園田土、沙子+營養土、蛭石+營養土、園田土+營養土為基質，分別移栽櫻桃砧木試管生根苗并觀察其移栽成活情況，一個月后統計試驗結果表明蛭石中移栽的櫻桃砧木試管生根苗成活率最高(見表9)。但是在蛭石中的櫻桃苗，后期會出現生長量小，葉片發黃等現象，一定要加強肥水管理，并在移栽成活后及時倒苗。表9不同栽培基質對櫻桃砧木組培生根苗移栽成活的影響基質沙子沙子+營養土蛭石蛭石+營養土營養土田土+營養土田土成活率(％)88.581.395.886.570.880.272.9依照上述的方法，我們已經建立了抗根癌櫻桃砧木的組培快繁技術方法，各項指標均達到了產業化生產的要求。有益效果1、由于本發明釆用了植物組織培養和篩選技術，因此釆用本發明技術方案可以快速獲得大量性狀穩定的抗根癌病櫻桃砧木；2、由于采用了本發明的技術方案，在試管苗時期即進行抗根癌病篩選，使得不具有抗性的櫻桃苗在早期即被排減少了培育的成本；3、采用本發明公開的擴繁培養基和培養條件，可以使抗根癌病櫻桃砧木試管苗的分化率達到100%,月增殖倍數達到6.6，并且生長良好，可以滿足大規模生產的需求；4、采用本發明公開的的生根培養基，使得抗根癌病櫻桃砧木試管苗生根率達到93.7%;5、采用本發明的技術方案改變了以往櫻桃砧木根癌病發病率高，造成樹勢弱，結果品質差，大樹易死亡的境況。具體實施方式根癌病櫻桃砧木苗的選育方法進行說明，以其它外植體為試管苗獲得抗根癌病櫻桃砧木苗的選育方法可以參照本本發明的選育方法進行。實施例1:1、外植體即抗根癌病櫻桃砧木試管苗的選擇取早春水培新梢或溫室苗的新梢，當新梢長到IO公分左右時，剪取新梢用于組培快繁的外植體材料；對所得的無菌試管苗進行抗根癌病篩選，選取抗根癌病櫻桃砧木試管苗，其步驟如下將無菌櫻桃砧木試管苗莖中下部接種農桿菌后，置于無激素的MS培養基中進行培養，40天后選取按癭瘤的重量分級為0級的抗根癌病櫻桃砧木試管苗作為后續操作的材料；2、擴繁培養經由步驟1對外植體的選擇，獲得無菌試管苗后，當小試管苗長到lcm以上時，切下小苗并將其轉移到擴繁培養基MS+6BA0.5mg/L上，溫度控制在20。C左右，光強1500Lx，光照12小時，促使櫻桃砧木試管苗增殖，經過增殖櫻桃砧木試管苗的分化率達到100%，月增殖倍數達到6.6，并且生長良好，可以滿足大規模生產的需求；3、壯苗培養將經由步驟2獲得的試管苗置于壯苗培養基MS+GA5mg/L，壯苗28天；4、生根培養經過步驟(3)壯苗培養后的櫻桃砧木試管苗，轉接到MS+IBA1.0mg/L的生根培養基中，促使櫻桃砧木試管苗的生根，生根率能達到93.7%;5、組培苗移栽當櫻桃砧木試管苗生根后，從培養容器中取出，洗凈瓊脂，進行移栽過渡，將過渡苗移栽到蛭石基質中，移栽過渡成活后的櫻桃砧木苗根據情況可以進行容器栽植或田間定植。實施例2:采用與實施例1相同的步驟，在步驟2中將試管苗擴繁的條件改為培養基MS+6BA1.0mg/L上，溫度控制在22。C左右，光強1800Lx，光照12小時，在步驟3中將壯苗培養條件改為壯苗培養基MS+GA7mg/L,壯苗30天，步驟4中的生根培養條件變為MS+NAA0.5mg/L的生根培養基中。實施例3:采用與實施例1相同的步驟，在步驟2中將試管苗擴繁的條件改為培養基MS+6BA1.1mg/L上，溫度控制在24。C左右，光強2000Lx,光照12小時，在步驟3中將壯苗培養條件改為壯苗培養基MS+GA8mg/L,壯苗31天，步驟4中的生根培養條件變為MS+NAA0.5mg/L的生根培養基中。實施例4:采用與實施例l相同的步驟，在步驟2中將試管苗擴繁的條件改為培養基MS+6BA2.Omg/L上，溫度控制在21。C左右，光強2500Lx,光照12小時，在步驟3中將壯苗培養條件改為壯苗培養基MS+GA10mg/L,壯苗31天，步驟4中的生根培養條件變為MS+IBA1.Omg/L的生根培養基中。以上所述，僅為本發明的較佳實施例而已，并非對本發明作任何形式上的限制，凡熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案范圍內，當可利用以上所揭示的技術內容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發明的等效實施例；同的更動、修飾與演變等，均仍屬于本發明的技術方案的范圍內。權利要求1、一種抗根癌病櫻桃砧木苗的選育方法，它包括以下步驟(1)、無菌抗根癌病櫻桃砧木試管苗的選擇將無菌櫻桃砧木試管苗莖中下部接種農桿菌后，置于無激素的MS培養基中進行培養，選取抗根癌病櫻桃砧木試管苗；(2)、將步驟(1)獲得的抗根癌病櫻桃砧木試管苗置于擴繁培養基MS+6BA0.5-2.0mg/L上，在20℃-24℃溫度下，1500Lx-2500Lx光強的條件下，光照12小時，使抗根癌病櫻桃砧木試管苗增殖；(3)、將步驟(2)中增殖的抗根癌病櫻桃砧木試管苗置于壯苗培養基MS+GA5-10mg/L，壯苗28-31天；(4)、將經步驟(3)壯苗后的抗根癌病櫻桃砧木試管苗轉接到生根培養基中，進行生根培養；(5)、將生根后的抗根癌病櫻桃砧木試管苗移栽到育苗移栽基質中進行栽培獲得抗根癌病櫻桃砧木苗。2、根據權利要求1所述的選育方法，其特征在于步驟(4)中所述的生根培養基為MS+IBA1.0mg/L或MS+NAA0.5mg/L。3、根據權利要求1所述的選育方法，其特征在于所述步驟(5)中的育苗移栽基質為蛭石。4、權利要求1步驟(2)中使用的培養基，其特征為所述培養基的組成為MS+6BA0.5-2.0mg/L。5、權利要求1步驟(3)中使用的培養基，其特征在于所述的培養基為MS+GA5-10mg/L。6、權利要求1步驟(4)中使用的培養基，其特征在于所述i咅養基為MS+IBA1.Omg/L或MS+NAA0.5mg/L。全文摘要本發明一種抗根癌病櫻桃砧木苗的選育方法屬于農業中的果樹繁殖和選育方法，具體涉及一種采用組培快繁技術快速篩選和繁殖生產抗根癌病櫻桃砧木苗的方法，包括無菌抗根癌病櫻桃砧木試管苗的選擇、試管苗的增殖擴繁培養、試管苗的壯苗培養、試管苗的生根培養和試管苗的移栽培養步驟，由于采用了本發明所述的技術方案使得本發明具有可以快速獲得大量性狀穩定的抗根癌病櫻桃砧木、減少了培育成本、改變了以往櫻桃砧木根癌病發病率高，造成樹勢弱，結果品質差，大樹易死亡境況的有益效果。文檔編號A01H4/00GK101161058SQ20071018797公開日2008年4月16日申請日期2007年11月19日優先權日2007年11月19日發明者劉蘭英,張軍民,李春玲,磊邵申請人:北京市海淀區植物組織培養技術實驗室