專利名稱：一種鑒定瓠瓜類型砧木品種真實性的方法
技術領域：
本發明屬于生物領域，特別涉及甬砧系列瓠瓜類型砧木品種‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬站4號’和‘甬站5號’真實性的一種鑒定方法。
背景技術：
西瓜枯萎病引發連作障礙，在瓜類種植區普遍發生，是瓜類生產的重大難題。據統計，每年西瓜枯萎病的發病率可達10-30%，嚴重地塊甚至絕產，造成巨大經濟損失。目前，由于土地資源限制和枯萎病病原菌的頑固性，輪作和化學防治效果不佳，且存在環境污染和食品安全等問題，因此，嫁接是西瓜生產中用以克服連作障礙和枯萎病的有效手段。甬砧系列是寧波市農業科學研究院重點針對西瓜嫁接栽培，自主育成的一系列瓠瓜類型砧木品種。它主要包括甬砧I號(早熟栽培西瓜嫁接專用砧木)、甬砧3號(長季節 栽培西瓜嫁接專用砧木)、甬砧4號(耐溫度逆境西瓜嫁接專用砧木)，和甬砧5號(小果型西瓜嫁接專用砧木)。該系列抗性強、嫁接性能好、對西瓜品質無不良影響、產量高，瓜農增益明顯。隨著甬砧系列的推廣，鑒別品種真實性對維護生產者和育種者的利益日益重要。然而，目前砧木品種的鑒定多運用種子或植株形態學鑒定等常規方法。這些方法耗時長、易受環境影響、可靠性差，面對品種繁多、外觀表型相似、而遺傳基礎相對狹窄的砧木材料，鑒定真偽難以奏效。石占木新品種‘甬石占I號，、‘甬石占3號，、‘甬石占4號’和‘甬石占5號’至今只作了大田形態學純度鑒定，尚缺乏便捷有效的品種真實性鑒定方法，對于品種保護還遠遠不夠。
發明內容
針對上述問題，本發明提供一種利用DNA指紋圖譜鑒定甬砧系列瓠瓜類型砧木品種‘甬站I號’、‘甬站3號’、‘甬站4號’和‘甬站5號’品種真實性的方法。為實現本發明的目的，發明者提供以下技術方案采用CTAB法提取‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’和‘甬砧5號’及其對照品種的幼葉DNA ;利用4個RAPD引物和3對SSR引物進行PCR擴增(引物名稱與序列表中序列號的對應關系如表I所示，引物具體序列見本說明書最后一頁所附序列表)；擴增產物經瓊脂糖電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測多態性。擴增產物的多態性反映了基因組的多態性。有差異的等位位點，擴增出條帶的記為“1”，同一位置無帶記為“O” ；將這些差異擴增片段轉換為由I和O組成的字符串，即構成DNA指紋圖譜，用以區分4份瓠瓜類型砧木品種及其對照。本發明的優點與常規形態鑒定比較，本發明的鑒定結果準確可靠、耗時短、不受環境影響、操作簡單，可以同時鑒定多個品種，方便快捷。
四
圖I為本發明實施例中，RAPD引物s23、s24、sl48、s255 (左)和SSR引物S1001/1002、S1109/1110、S1127/1128(右)在‘甬砧 I 號’、‘甬砧 3 號’、‘甬砧 4 號’、‘甬石占5號’及其對照材料‘神通力’和‘京欣砧I號’中的擴增。圖I中左側四幅圖片自上而下分別是RAro引物s23、s24、sl48、s255在‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬站4號’、‘甬砧5號’及其對照材料‘神通力’和‘京欣砧I號’中的擴增;右側三幅圖片自上而下分別是SSR引物S1001/1002、S1109/1110、S1127/1128在‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’、‘甬砧5號’及其對照材料‘神通力’和‘京欣砧I號’中的擴增。兩組圖片樣品排列順序自左至右依次為DNA Marker、‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’、‘甬砧5號’、‘神通力’和‘京欣砧I號’。圖片左側標注是DNA marker標準分子量，右側標注是引物名稱及差異位點所在片段大小。
五具體實施例方式I、取樣播種‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’、‘甬砧5號’及其對照，待植株長至5-6片真葉時，采集嫩葉lg，_80°C保存。 2、DNA 提取參照 CTAB 法(見Murray HG, Thompson WF. Rapid isolation ofhigher weight DNA. Nucleic Acids Res, 1980,8 :4321),提取新鮮葉片總基因組 DNA。3、PCR 擴增RAPD 和 SSR 的混樣體系均為 15 μ I (Fazio G, Staub JE, StevensMR. Genetic mapping and QTL analysis of horticultural traits in cucumber(Cucumissativus L.)using recombinant inbred lines. Theor Appl Genet,2003,107 :864-874),包括 1·5μ1 dNTP(l. 25mM), I. 5ul 10 X buffer, I. 5ul MgCl2 (25mM)，2. Oul 引物(5mM ;SSR兩條引物分別添加 1.0ul)，5ul DNA(10ng/ul),0. 05ul Taq (IU)，3. 45ul 超純水。RAPD 的PCR擴增程序為預變性94°C 4min ;變性93°C 15sec，退火37°C lmin30sec，延伸72°C2min(40個循環);延伸72 °C 6min。SSR的PCR擴增程序為預變性94°C Imin ;變性93 °Clmin，退火 40°C lmin，延伸 72°C 2min(40 個循環);延伸 72°C Imin04,PCR產物檢測RAPD擴增產物使用2%普通標準凝膠瓊脂糖(DNA片段分離范圍500-20Kbp)，SSR使用2. 5%高分辨率標準凝膠瓊脂糖(DNA片段分離范圍40_lKbp)。添加20 μ I EB (ethidium bromide,溴化乙淀)顯色。在 PCR產物中加入 2μ I Loading Dye,電泳2-3小時，電壓200-250V。電泳結束后，利用凝膠成像系統觀察結果。5、數據收集與分析對4個RAPD引物s23、s24、sl48、s255和3對SSR引物S1001/1002、S1109/1110、S1127/1128 在‘甬砧 I 號’、‘甬砧 3 號’、‘甬砧 4 號’、‘甬砧 5號’及對照材料‘神通力’和‘京欣砧I號’的擴增結果進行賦值，某等位基因擴增出條帶的記為“1”，同一位點無擴增條帶的記為“O”。將這些差異擴增片段轉換為由I和O組成的字符串，即構成品種指紋圖譜(表I)。利用7個分子標記產生的11個多態性位點，構建‘甬砧I號’的指紋圖譜為o-i-i-i-o-o-i-o-i-i-o，‘甬砧3號’的指紋圖譜為1-0-0-0-0-0-1-1-0-0-0, ‘甬砧 4 號’的指紋圖譜為 1-1-1-0-1-0-1-0-1-1-0，‘甬砧 5 號’的指紋圖譜為 0-0-1-1-0-0-1-1-0-0-1，‘神通力’的指紋圖譜為 0-1-1-0-1-0-1-1-0-0-1，
‘京欣砧I號’的指紋圖譜為0-0-0-0-0-1-0-0-0-1-0。這些指紋圖譜不僅可以有效區分上述四個品種，還可以將它們從形態易混淆的相似品種中甄別出來，起到品種鑒定與保護的作用。表I供試瓠瓜類型砧木品種及對照編號、名稱和RAPD/SSR指紋圖譜
權利要求
1.本發明用以鑒定‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’和‘甬砧5號’所使用的方法。本發明利用4個RAro引物(SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 4)和3對SSR引物(SEQ IDNO. 5-SEQ ID NO. 10)，對瓠瓜類型砧木品種‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’和‘甬砧5號’及對照進行PCR擴增，擴增產生的11個差異位點經過“I”和“O”的賦值，構建品種DNA指紋圖譜用以真實性鑒定。發明者提供的技術方案與鑒定指標模糊、鑒定結果易受環境影響的常規形態學鑒定相比，具有鑒定手段靈敏、時間人工成本低、結果準確等優點，且對于批量材料的鑒定更方便。請求對以下權利進行保護
2.本發明用以鑒定‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’和‘甬砧5號’所使用的4個RAPD 引物和 3 對 SSR 引物的序列，包括 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ IDNO. 4,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10。
全文摘要
本發明題為《一種鑒定‘甬砧1號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’和‘甬砧5號’品種真實性的方法》，屬于生物領域。鑒別品種真實性對維護生產者和育種者的利益日益重要。砧木品種繁多外觀相似，利用形態指標甄別真偽，耗時長可靠性差。為此，發明一種利用分子標記鑒定砧木品種真實性的方法成為當務之急。技術方案為利用4個RAPD引物(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4)和3對SSR引物(SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.10)，對四個品種及對照進行PCR擴增，產生的11個差異位點經過“1”和“0”賦值，構建品種指紋圖譜用以真實性鑒定。發明以更靈敏的鑒定手段、更低的時間人工成本，對瓠瓜類型砧木品種‘甬砧1號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’和‘甬砧5號’進行更準確更有效的鑒定與保護。
文檔編號C12Q1/68GK102925551SQ20121031865
公開日2013年2月13日 申請日期2012年8月23日 優先權日2012年8月23日
發明者宋慧, 王毓洪, 張香琴, 應泉盛, 王迎兒, 嚴蕾艷 申請人:寧波市農業科學研究院