專利名稱：一種應用于仔豬養殖中取代藥物添加劑的復合微生物菌劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物學、畜牧業、生物技術等領域，具體涉及一種 應用于仔豬養殖中取代藥物添加劑的復合微生物菌劑。
背景技術：
在動物的胃腸道中，存在相對穩定殖居的微生物群落，而且數量
相當大，約為10"個微生物，分別來自400個不同的細菌類型。其中有 一些微生物對維持胃腸道環境的相對穩定和促進營養物質在腸道的 消化與吸收起著相當重要的作用。Fuller研究發現，腸道內相對穩定
的微生物群落的形成，有助于動物提高抵抗力，免受外來有害細菌的 感染，特別是對正常健康動物的胃腸道的感染，無菌動物比具有完整 胃腸道微生物群落的動物更易感染疾病。由于微生物群落在動物胃腸 道內的特殊功效，動物微生態學的概念和理論被提出并完善。在動物 養殖業中，利用動物微生態學理論，依據動物胃腸道微生態系統的客 觀規律，因勢利導，改善胃腸道的微生態環境，建立生物量更高的微 生態平衡，從而起到促生長，防疾病的功效。其成功應用表現在微生 態制劑(Prabiotics)在畜禽飼料中使用，具有極其良好的飼養效果。微 生態制劑的作用機理l.對病原菌的拮抗作用，益生菌通過占據腸黏
膜上的黏附位點阻止病原菌的附著，并在腸道內和病原菌競爭營養 素，產生有機酸、&02及其它抗菌物質等，抑制病原菌的生長繁殖， 從而達到抗菌治病的作用；2.提供營養素，促進消化吸收，提高飼料 轉化率；3.刺激機體的免疫功能，增強機體免疫力；4.凈化腸道內環 境，動物自身及許多致病菌都會產生各種有毒物質，有些有益生菌可 以阻止毒性胺和氨的合成，中和細菌毒素。乳酸菌能夠產生有機胺和 抗菌物質，降低腸道內pH值和氧化還原電位，有利于宿主生長發育和 維持健康；5.減輕機體的應激反應，維持腸道微生態平衡
發明內容
本發明的目的在于提供一種應用于仔豬養殖中取代藥物添加劑 的復合微生物菌劑，利用該微生物菌劑取代藥物添加劑，提高動物抵 抗力，免受外來有害細菌的感染，促生長，防疾病。
本發明的技術解決方案是該復合微生物菌劑依以下步驟制備
1. 從健康豬的小腸中分離、純化菌種；無菌操作取得剛宰殺健康 豬小腸一段約4cm，用無菌刀片將腸黏膜刮下，倒入無菌水稀釋10 倍，攪拌2min，靜置10min，取上層清液1 mL，接種到50mL預增 菌培養液中，3(TC恒溫培養24h;其中，預增菌培養液為裝滿帶玻璃 塞瓶中的鮮牛奶；
2. 取預增菌液0.1mL，涂布到9cm直徑MRS培養基上，然后在 培養皿中再倒一層MRS培養基，在厭氧條件下3(TC培養36h;其中 MRS培養基牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g， 乙酸鈉5g，檸檬酸三銨2g，磷酸氫二鉀2g，吐溫-80 lmL， 硫酸
鎂0.58g，硫酸錳0.25g，調pH至6.2 6.4，蒸溜水定容lOOOmL， 121。C滅菌15min;
3. 對上述稀釋涂布厭氧培養所得單菌落進行選擇，其中鏈球菌、 乳桿菌為目的菌種；
4. 在MRS培養基上以質量5%接種目的菌種，溫度37-C發酵8
小時；
5. 第四步的鏈球菌、乳桿菌與實驗室保存的益生菌Xg02混合，
得到混合菌液，三種菌質量比為桿菌球菌Xg02=l:l:3;
6. 混合菌液依質量5%加入液體種子培養基中得液體種子，其中， 液體種子培養基中各組份百分比為蛋白胨0.85%，牛肉膏2.0%， 葡萄糖2.0%，酵母浸出物0.7%，肝浸液5%(v/v);其中肝浸液的制 備200g豬肝臟加500g水，煮沸，紗布過濾，取濾液；
7. 液體種子按質量12%添加到固體發酵培養基中，37'C發酵20 小時，發酵結束低于65t:干燥粉碎得固態粉劑微生物菌劑；其中， 固體發酵培養基為米糠47.0%，麩皮42.5%，葡萄糖10.5%，起始 pH6.5，水份68%。
本發明具有以下優點①組成飼用微生物菌劑的益生菌不產生 任何內外毒素，即無毒、無害、安全、無副作用，有利于促進體內菌 群平衡，具有較好的黏附性能，以活菌體形式發揮作用的益生菌耐酸、 耐膽鹽，益生菌株生長速度快、存活期長、易保存；②此微生物菌劑 含乳酸桿菌、鏈球菌等，活菌數大于10 9個/g，在仔豬養殖中添加量 少，增強抵抗力，飼養成本低。
圖l為仔豬生長曲線圖。
具體實施例方式
該復合微生物菌劑依以下具體步驟制備
1. 從健康豬的小腸中分離、純化菌種；無菌操作取得剛宰殺健康 豬小腸一段約4cm，用無菌刀片將腸黏膜刮下，倒入無菌水稀釋10 倍，攪拌2min，靜置10min，取上層清液1 mL，接種到50ml預增 菌培養液中，3(TC恒溫培養24h;其中，預增菌培養液為裝滿帶玻璃 塞瓶中的鮮牛奶；
2. 取預增菌液0.1mL，稀釋涂布到9cm直徑MRS培養基上，然 后在培養皿中再倒一層MRS培養基，在厭氧條件下3(TC培養36 h; 其中MRS培養基牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g， 乙酸鈉5g，檸檬酸三銨2g，磷酸氫二鉀2g，吐溫-80 lmL,硫酸 鎂0.58g，硫酸錳0.25g，調pH至6.2 6.4,蒸溜水定容1000mL， 121。C滅菌15min;
3. 對上述稀釋涂布厭氧培養所得單菌落進行選擇，其中鏈球菌、
乳桿菌為目的菌種；
4. 在MRS培養基上以質量5%接種目的菌種，溫度37'C發酵8
小時；
5. 第四步的鏈球菌、乳桿菌與實驗室保存的益生菌Xg02混合，
得到混合菌液，三種菌質量比為桿菌球菌Xg02=l:l:3;
6. 混合菌液依質量5%加入液體種子培養基中得液體種子，其中，
液體種子培養基中各組份百分比為蛋白胨0.85%，牛肉膏2.0%， 葡萄糖2.0%，酵母浸出物0.7%，肝浸液5%(v/v);其中肝浸液的制 備200g豬肝臟加500g水，煮沸，紗布過濾，取濾液； 7.液體種子按質量12%添加到固體發酵培養基中，37"C發酵20小 時，發酵結束低于65'C干燥粉碎得固態粉劑微生物菌劑；其中，固 體發酵培養基為米糠47.0%，麩皮42.5%，葡萄糖10.5%，起始 pH6.5,水份68%。
實驗仔豬的選擇品種相同的痩肉型健康斷奶仔豬25頭，體重 8公斤左右，性別比例相當，試驗在斷奶后一周進行，在試驗準備 期內對所有試驗豬進行常規的免疫和驅蟲。
實驗仔豬的分組將所有試驗豬進行編號，隨機分成五組，每 組5頭，五組的編號為l、 2、 3、 4、 5，第l組為對照組，2、 3、 4、 5組為試驗組。
微生物菌劑在日糧中的濃度配比將微生物菌劑按質量比(即微 生物菌劑與日糧的質量之比)按0.5%>， 1%。， 2%。， 4%。的比例分別 摻加到2， 3， 4， 5組仔豬的日糧中。
飼喂方法第1組仔豬供應添加常規量抗生素(黃霉素在仔豬曰 糧中的使用量為10mg/kg)的基礎日糧，實驗結束時做對照組；實驗 組喂養添加了微生物菌劑的日糧；每日喂料兩次，分別于上午7: 30—8: 00和下午5: 00—5: 30飼喂，所有實驗豬均自由采食，并 隨時供給潔凈的飲水。
實驗仔豬的相關信息收集如表1、 2、 3和圖1所示，圖1為仔豬體重
變化曲線，表1為仔豬的始末重量表，表2為五組仔豬增重重量因素 方差分析表，表3為飼料報酬對比表。
表1仔豬的始末重表
表1仔豬始末重量
組別頭數實驗天數平均始重 平均末重總增重平均日增重
(公斤)(公斤)(公斤)(克)
第l組5408. 3023. 2614. 96374.0
第2組5408. 3725. 7616. 39409.8
第3組5408. 2527. 0818. 83470.8
第4組5408. 6628. 3719. 71492.8
第5組5408.4328. 1519. 72493. 0
表2五組仔豬增重重量單因素方差分析表組別仔豬平均重量Xij和Ti平均平方和
1 8.3012. 3016. 0419. 64 23. 2379. 5415.911404
2 8.3712. 6716. 8520.82 25. 7684. 4716. 891612
3 8.2513. 1517. 9722. 68 27. 0889. 1317. 531812
4 8.6613. 7618. 8223.75 28. 3793. 3618. 671987
5 8.4313. 3818. 4923. 34 28. 1591. 7918. 361929
總和T. =438. 29總平均^..=17. 538744
仔豬的飼料報酬率對比情況表組別頭數實驗天數總耗料量總增重量料肉比比較
(公斤)(公斤)
第l組540173.5474. 802. 320100
第2組540180.6481.952. 20495
第3組540191. 7794. 152. 03787.8
第4組540194. 2598. 551.97185.0
第5組540194.4498. 601.97185.0
9組別頭數實驗天數平均始重 平均末重總增重平均日增重
(公斤)(公斤)(公斤)(克)
第l組5408. 3023. 2614. 96374.0
第2組5408. 3725. 7616. 39409.8
第3組5408. 2527. 0818. 83470.8
第4組5408. 6628. 3719. 71492.8
第5組5408.4328. 1519. 72493. 0
表2五組仔豬增重重量單因素方差分析表組別仔豬平均重量Xij和Ti平均平方和
1 8.3012. 3016. 0419. 64 23. 2379. 5415.911404
2 8.3712. 67 由表和圖可知在仔豬日糧中按照不同比例添加微生物菌劑，對 仔豬的生長具有明顯的促進作用，其中2%。添加量組與對照組相比， 平均日增重提高31.8%，料肉比降低了15%，腹瀉率降低了91.4% 。
權利要求
1. 一種應用于仔豬養殖中取代藥物添加劑的復合微生物菌劑，其特征在于該復合微生物菌劑依以下步驟制備(1)從健康豬的小腸中分離、純化菌種；無菌操作取得剛宰殺健康豬小腸一段4cm，用無菌刀片將腸黏膜刮下，倒入無菌水稀釋10倍，攪拌2min，靜置10min，取上層清液1mL，接種到50ml預增菌培養液中，30℃恒溫培養24h；其中，預增菌培養液為裝滿帶玻璃塞瓶中的鮮牛奶；(2)取預增菌液0. 1mL，稀釋涂布到9cm直徑MRS培養基上，然后在培養皿中再倒一層MRS培養基，在厭氧條件下30℃培養36h；其中MRS培養基牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，檸檬酸三銨2g，磷酸氫二鉀2g，吐溫-80 1mL，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，調pH至6.2～6.4，蒸溜水定容1000mL，121℃滅菌15min；(3)對上述稀釋涂布厭氧培養所得單菌落進行選擇，其中鏈球菌、乳桿菌為目的菌種；(4)在MRS培養基上以質量5％接種目的菌種，溫度37℃發酵8小時；(5)第四步的鏈球菌、乳桿菌與實驗室保存的益生菌Xg02混合，得到混合菌液，三種菌質量比為桿菌球菌Xg02＝1:1:3；(6)混合菌液依質量5％加入液體種子培養基中得液體種子，其中，液體種子培養基中各組份百分比為蛋白胨0.85％，牛肉膏2.0％，葡萄糖2.0％，酵母浸出物0.7％，肝浸液5％(v/v)；其中肝浸液的制備200g豬肝臟加500g水，煮沸，紗布過濾，取濾液；(7)液體種子按質量12％添加到固體發酵培養基中，37℃發酵20小時，發酵結束低于65℃干燥粉碎得固態粉劑微生物菌劑；其中，固體發酵培養基為米糠47.0％，麩皮42.5％，葡萄糖10.5％，起始pH6.5，水份68％。
全文摘要
本發明公開了一種應用于仔豬養殖中取代藥物添加劑的復合微生物菌劑，依以下步驟制備無菌操作取得剛宰殺健康豬小腸一段，用無菌刀片將腸黏膜刮下，倒入無菌水稀釋10倍，攪拌2min，靜置10min，取上層清液1mL，接種到預增菌培養液中，30℃恒溫培養24h；在MRS培養基上以質量5％接種目的菌種，溫度37℃發酵8小時；培養后目的菌種與實驗室保存的益生菌Xg02混合得到混合菌液；混合菌液依質量5％加入液體種子培養基中得液體種子；液體種子按質量12％添加到固體發酵培養基中，發酵結束低于65℃干燥粉碎得固態粉劑微生物菌劑；在仔豬養殖中利用微生物菌劑取代藥物添加劑，提高動物抵抗力，免受外來有害細菌的感染，促生長，防疾病。
文檔編號A23K1/16GK101380335SQ20081015546
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月6日 優先權日2008年10月6日
發明者李相前 申請人:淮陰工學院