專利名稱：：豐加霉素在制備植物疫病防治藥物上的應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬生物農藥
技術領域：
，涉及豐加霉素的藥物新用途，具體是利用核苷類化合物豐加霉素及其產生微生物在制備防治植物疫病藥物方面的新用途。
背景技術：
：植物疫病是由卵菌綱，疫霉屬(戶/^top似/zom)菌物引起的病害，全世界已報道的疫霉屬菌物有80多種(Ho，1990)，疫霉的寄主范圍廣，寄主植物達1000多種(Gregory,1983)，如樟疫霉(戶c/wrawow/)能引起900多種植物根腐爛(Zentmyer,1980)，棕櫚疫霉(P戶/m/vora)和戶me^^70^是熱帶作物的重要病原菌，引起可可葉枯、莖根腐爛和潰瘍(Appiah,1999)。辣椒疫霉(Pcf戸/c/)、煙草疫霉(/!w'co^"ae)是橡膠、胡椒、菠蘿、劍麻等熱帶作物和果蔬、花卉、林木的重要病原菌，引起根腐病、幼苗猝倒病以及莖基部、塊莖、球莖、葉等的腐爛病，每年都造成嚴重的經濟損失。針對這類病害，雖然已有瑞毒霉系列、霜脲氰系列等高效內吸化學殺菌劑可用于疫病的防治，但是防治效果不是很理想，再加上長期使用化學農藥不僅對環境造成了很大的污染，而且疫霉菌對已使用過的一些內吸殺菌劑也易產生抗藥性。生物防治被認為是持續控制土傳疫霉菌病害發生的有效途徑,且不會引起環境污染,具有很大的發展潛力，因此，研究和開發廣譜高效的新型農用抗生素或生防活菌制劑，在我國農業生產乃至國際上都具有十分重要的意義。豐加霉素最初報道是由豐加鏈霉菌(5Yrepto/z7/cesz^^cae;s^278)產生(Intern丄Syst.Bacteriol.,1968,18:174-176)，具有抗腫瘤、抗菌和除草等多種活性。0.018嗎/mL豐加霉素可以抑制HeLa細胞，對淋巴白血病，L-1210、艾氏腹水癌等動物實驗有效([P].GB764198,1956,12.);對白色念珠菌、煙曲霉、金黃色葡萄球菌耐藥菌和腸球菌也有抑制作用(中國抗生素雜志，2004,10:577)，但未見有用于植物疫病防治的報道。豐加霉素的結構如下本發明的目的是提供豐加霉素的一種新的藥物用途，即豐加霉素在制備植物疫病防治藥物上的應用。本發明的豐加霉素有多種獲得方法，屬于已知工藝和成熟技術，可利用多種常規分離手段從微生物中分離獲得或者通過合成以及半合成手段獲得。本發明的豐加霉素是一種藥物活性成分，按照常規的制劑工藝，H3'l2'lHOHOH
發明內容可以以豐加霉素為活性成分，加入常規的藥物輔料，制成任何一種適合于使用的劑型，如水劑、可濕性粉劑、粒劑等，用于植物疫霉屬CP/^op/^/ora)菌物引起的等多種植物疫病的防治。由于本發明首次公開了豐加霉素防治植物疫病的藥物作用，因此，將豐加霉素單獨或與其它活性成組分或輔料配合制作藥劑，只要該藥用于防治植物疫病，均屬于本發明的保護范圍。相應地，根據豐加霉素在防治植物疫病上的機理，其所產生的微生物也具備防治植物疫病的藥物作用，以豐加霉素所產生的微生物為活性組分制備成農業藥物用于植物疫病的防治，也屬于本發明的保護范圍。豐加霉素所產生微生物是白淺灰鏈霉菌(Streptomycesalbogriseus)BMIO、白刺鏈霉菌(Streptomycesalbospinus)WZ254菌株、豐加鏈霉菌(Streptomycestoyocaensis)278菌株、龜裂鏈霉菌Streptomycesrimosus(ATCC14673)、豐加鏈霉菌無刺霉素變種(Streptomycestoyocaensisvar.aspiculamyceticus)等鏈霉菌或者其它微生物。為了能更好地理解本發明所述的豐加霉素的新的藥物用途，下面用發明人從對辣椒疫霉菌具有強抑菌作用的白淺灰鏈霉菌BM10和白刺鏈霉菌(S^ptom^c"a/6o^'mw)WZ254的發酵液中分離出核苷類化合物-豐加霉素，進行了對抗辣椒疫霉菌抑制活性測定和對辣椒疫病的田間防治效果試驗，說明豐加霉素在防治植物疫病方面的新用途。1、濾紙片對峙培養法測定核苷類化合物SR-1(豐加霉素)對疫霉菌的抑制活性將SR-1(豐加霉素)樣品配制成0.01g/ml的待測樣品、設甲醇溶劑對照組和滅菌水對照組，用直徑6mm打孔器分別在培養4天的辣椒疫霉和煙草疫霉培養平板上打取菌餅，轉接于PDA培養平板中間，于28"C培養24小時后在距菌落邊緣2.0cm處放置滅菌過的濾紙圓片(直徑6mm)，每皿放置3片，分別在紙片中加入20pL水、甲醇溶劑和0.01g/ml的SR-l，每個處理重復3次，待紙片上的液體揮干后，蓋上皿蓋，至于28-C培養5d后，測量其抑菌距離。試驗結果(表1)表明，SR-1(豐加霉素)對辣椒疫霉和煙草疫霉具有強抑制活性，其平均抑菌距離分別為18mm和17mm，而對照滅菌水和甲醇溶劑則沒有抑菌活性。表l化合物SR-1(豐加霉素)對疫霉菌的抑制活性的濾紙片法測定結果化合物SR-1的抑菌距離甲醇溶劑對照的抑滅菌水對照的抑菌指示菌__菌距離(mm)_距離(mm)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、抑制菌絲生長速率法測定核苷類化合物SR-1(豐加霉素)對疫霉菌的抑制活性將化合物SR-1(豐加霉素)稀釋成一定濃度，加入到冷卻至50'C左右的PDA培養基中，制成含SR-1濃度為0.01mg/mL的PDA培養基平板，以不加任何藥物的PDA平板為對照，在制備好的PDA平板中央接入直徑6mm的辣椒疫霉和煙草疫霉菌塊，每處理重復3次，于28-C下培養5天，用十字交叉法測量疫霉菌菌落直徑，按下列公式計算菌絲生長抑制率。歸翻率，對照gg菌落能x腦試驗結果(表2)表明，化合物SR-1(豐加霉素)在測試濃度0.01mg/mL下完全抑制了辣椒疫霉菌和煙草疫霉菌的菌絲生長。表2化合物SR-1(豐加霉素)抑制疫霉菌菌絲生長的測定結果處理辣椒疫霉菌落直徑(mm)平均相對煙草疫霉菌落直徑(mm)平均相對抑IIIIII平均抑制率(％)III111平均制率(％)SR-100001000000100對照82868484/86858786/3、豐加霉素對辣椒疫病的田間防治效果試驗本試驗在中國熱帶農業生物技術研究所試驗基地進行，試驗方法參考《農藥田間藥效試驗準則》，試驗設4個處理處理一，噴施BMIO菌株發酵液上清液1800mL;處理二，噴施濃縮10倍的BMIO菌株發酵上清液18001mL;處理三，噴施72%甲霜靈*錳鋅(大連瑞可德生物科技有限公司生產)600倍液1800mL;(4)對照，噴清水1800mL。每處理重復3次，每個小區面積6m2，隨機區組排列，栽種辣椒苗45株。辣椒苗定植一周，于辣椒幼苗基部接辣椒疫霉菌(用V8培養基28°C下培養4天，切取菌塊水培24小時待產生大量孢子囊后接種)，待有部分辣椒苗輕微發病后開始施藥，每隔7天噴施一次，連續噴施三次，第三次施藥一周后調查防治效果。發病百分率和防治效果分別按如下公式計算發病株數發病率(％)=-xioo調査總株數吐v^r田，《v、對照區發病率—處理區發病率v，防治效果(%)=~對駆發病率-X100發病百分率和防治效果百分率經平方根反正弦轉換后進行方差分析和Duncan，s多重比較。鏈霉菌BM10菌株發酵液濃縮10x液、發酵原液、600x72%的甲霜靈和對照等四個處理的平均辣椒疫病發病率、平均防治效果統計分析結果見表3。_表3豐加霉素防治辣椒疫病的田間試驗結果_平均發病率(％)平均相對防治效果(％)—處理第3次施第3次施藥第3次施藥第3次施藥第3次施藥第3次施藥_藥后7天后14天后21天后7天后14天后21天BM10發酵上清液濃縮10倍液2.30aA3.7aA5.19aA82.61aA88.02aA89.96aABM10發酵液上清液(原液)3.7aA5.2abA8.1aA78.9aA82.5abA84.4aA72%的甲霜靈錳鋅600倍液4.44aA9.6bcA18.52bB73.68aA68,49bA64.35bB__17.8bB30.4cB51.9cC/_^_^_~~a,b,表示在P〉0.05的差異顯著性水平；A，B，C，表示在P>O.Ol的差異顯著性水平從各處理發病率和防治效果的統計分析結果可知，第三次噴藥7天后，BM10發酵液上清濃縮10倍液、BM10發酵原液、72%的甲霜靈錳鋅600倍液等處理的發病率分別為2.3%、3.7%、4.44%,防治效果分別為82.61%、78.9%、73.68%，三種藥劑處理的發病率均極顯著低于對照區發病率17.8%，三種藥劑處理間的發病率和防治效果差異不顯著；第三次噴藥14天后，BM10發酵液上清濃縮10倍液、BM10發酵原液、72%的甲霜靈*錳鋅600倍液等處理的發病率分別為3.7%、5.2%、9.6%,防治效果分別為88.02%、82.5°/。、68.49%,BM10發酵液上清濃縮10倍液和BM10發酵原液處理的發病率均極顯著低于對照發病率30.4%,72%的甲霜靈"錳鋅600倍液處理的發病率與對照發病率差異未達顯著水平，BM10發酵液上清濃縮10倍液的防治效果顯著高于72%的甲霜靈錳鋅600倍液處理，發酵原液處理與72%的甲霜靈錳鋅600倍液處理的防治效果差異不顯著；第三次噴藥21天后，BM10發酵液上清濃縮10倍液、BM10發酵原液、72%的甲霜靈'錳鋅600倍液等處理的發病率分別為5.19%、8.1%、18.52%,防治效果分別為89.96%、84.4%、64.35%，BM10發酵液上清濃縮10倍液處理和發酵原液上清液處理的發病率極顯著低于72%甲霜靈錳鋅600倍液處理和對照的發病率51.9。/。，BM10發酵液上清濃縮10倍液和發酵原液處理的發病率差異不顯著，BM10發酵液上清濃縮10倍液處理和發酵原液上清液處理的防治效果均極顯著高于72%甲霜靈錳鋅600倍液處理的防治效果，而BM10發酵液上清濃縮10倍液處理和發酵原液上清液處理的防治效果差異不顯著。以上試驗數據分析結果表明，噴施BM10發酵液上清濃縮10倍液和BM10發酵液上清液均對辣椒疫病具有良好的防治效果，防治效果達82%以上，其中發酵液上清濃縮10倍液顯著高于72%甲霜靈錳鋅600倍液的防效，而BM10發酵液上清液的防治效果則與72%甲霜靈*錳鋅600倍液相當。本發明公開了豐加霉素的藥物新用途，通過實驗驗證豐加霉素具有較好的抑制疫霉屬菌物的作用，可廣泛應用于防治植物疫病的藥物中，對于植物疫病的防治具有良好的效果，且長期使用不會對環境造成了很大的污染。具體實施例方式下面結合具體實例對本發明作進一步闡述，但不限制本發明。實施例一核苷類化合物SR-1(豐加霉素)的提取分離MgS04'7H200.2g，瓊脂20.0g，水1000mL，pH值7.0;黃豆粉培養基黃豆粉10g，葡萄糖10g，CaC030.2g，MgS04'7H200.2g，水lOOOmL，pH值7.0。b、菌株BM10采用二級發酵，首先將菌種BMIO轉接于平板培養基上，于28。C培養46d后，接種于種子培養基(黃豆粉培養基)，于28°C、200r/min搖床上培養3d，轉接于發酵培養基(同種子培養基)，在28。C、200r/min搖床上培養56d。c、發酵液經8000r/min離心20min，將上清液于45°C減壓濃縮至原體積的1/50，用乙酸乙酯萃取三次，減壓濃縮得乙酸乙酯浸膏(17.3g)。乙酸乙酯浸膏(17.3g)經硅膠柱層析，以氯仿-甲醇梯度洗脫得到8個流份(Fr.l-8)，每個組分經上述活性測試方法進行活性測試，確定組分Fr.4為活性組分，Fr.4經多次重結晶得到SR-l(3.0g)單一活性組分。實施例二核苷類化合物SR-1(豐加霉素)化合物的結構鑒定利用光譜技術，包括紫外、紅外、核磁共振及高分辨質譜分析，鑒定了實施例1中的SR-1化合物的結構。運用13C-NMR,^-NMR數據進行了歸屬。化合物SR-1(豐加霉素)的理化常數:白色針狀結晶，高錳酸鉀顯淺黃色，[a]D=-45°C(c=1.05in0.1mol/HCL)，在ESI誦MS(m/z)中，出現292[M+H]+，314[M+Na]+峰，分子式C12H13N504，分子量291。核苷類化合物SR-1(豐加霉素)的UC-NMR和'H-NMR數據"C-NMR(100MHz，DMSO-d6)3156.9(C國4),153.4(C曙2),150.0(C國8)，132.3(C國6)，115.2(CN)，101.2(C-9),87.7(C-l')，85.4(C-4')，82.9(C-5)，74.1(C誦2')，70.1(C-3')，61.1(C-5');(400MHz，DMSO-d6)38.22(1H,s),8.44(lH，s),6.91(2H，s,4-NH2)，6.06(lH，d，《/=5.6Hz)，5.46(lH,d,/=6.0Hz)，4.37(lH，dd，/=11.0，5.5Hz)，5.20(2H,m)，3,93(lH，dd，/=7.2，3.6Hz)，4.09(lH，dd，J=9.0，4.5Hz)，3.61(2H，m)。權利要求1、豐加霉素在制備植物疫病防治藥物上的應用。2、根據權利要求1所述的應用，其特征在于將豐加霉素單獨或與其它活性成組分或輔料配合制作藥劑。3、根據權利要求l所述的應用，其特征在于將豐加霉素所產生的微生物在制備植物疫病防治藥物上的應用。4、根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述豐加霉素所產生的微生物是白淺灰鏈霉菌BMIO、白刺鏈霉菌WZ254菌株、豐加鏈霉菌278菌株、龜裂鏈霉菌、豐加鏈霉菌無刺霉素變種。全文摘要本發明公開了豐加霉素的藥物新用途，即豐加霉素在制備植物疫病防治藥物上的應用。通過實驗驗證豐加霉素具有較好的抑制疫霉屬菌物的作用，可廣泛應用于防治植物疫病的藥物中，對于植物疫病的防治具有良好的效果，且長期使用對環境不會造成污染。文檔編號A01N43/90GK101444216SQ200810189738公開日2009年6月3日申請日期2008年12月29日優先權日2008年12月29日發明者瑞商,戴好富,曾會才,梅文莉,陳漢清申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所