一種活性物質為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑的制作方法

專利名稱：：一種活性物質為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種微生物殺蟲劑，尤其是涉及一種活性物質為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其為一種通過微生物發酵后提取得到的具有殺蟲活性的堿性蛋白酶和以其為主要活性物質的高效微生物殺蟲劑。二
背景技術：
：自九十年代以來，全球化學農藥以每年2%左右的比例下降，而生物農藥的產量每年以10%_20%的速度遞增。由于長期施用化學農藥，農田生態平衡遭到了嚴重破壞，害蟲防治難度日益增大'。其次，農產品的農藥殘留對人類造成了巨大威脅，并嚴重影響我國農產品的出口，而生物防治剛好能克服諸多弊端。目前，全世界生物農藥產品已經超過100多種，其中生物技術產品有10余種。在生物農藥中，90°%以上是微生物殺蟲劑。隨著對濫用化學農藥危害性的認識，以及對無公害綠色食品的需求和對環境保護意識的增強，人們清楚地認識到應用微生物殺蟲劑不僅是單純的治蟲，而且有利于保護環境，有利用于生態平衡，有利于民族健康。微生物具有易培養、易進行大規模工業化生產等特點，因此從微生物的代謝產物中尋找高效低毒、易被分解的殺蟲物質成為微生物殺蟲劑研究的熱點。由于生物農藥中產品開發方面有明顯優勢，世界各國都爭相投資，研究和開發新型生物農藥。在自然界，存在著許多對害蟲有致病作用的微生物，利用這種致病性來防治害蟲是一種有效的生物防治方法。我們可以從這些病原微生物中篩選出施用方便、藥效穩定、對人畜和環境安全的菌種，進行工業規模的生產開發，從而制成微生物殺蟲劑。微生物殺蟲劑是生物科學與工程技術結合發展的產物，隨著現代生物工程的迅速發展，微生物殺蟲劑將有很大的開/O.、/*曰發刖景。
發明內容本發明為了解決上述
背景技術：
中的不足之處，提供一種活性物質為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其低殘留、殺蟲譜廣、高效、能降解、選擇性強。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種活性物質為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其特征在于包括以下重量百分比的組分堿性蛋白酶9%-16%表面活性劑10/0-2%高滲劑1%-1.5%增效劑1%-3%助劑3%-5%水68%_84%上述表面活性劑為苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚，助劑為三聚磷酸鈉，增效劑由氯化鎂、亞硫酸鈉、硝酸銨、蔗糖和5種原料中的2種或2種以上的原料組配而成，所含各種原料及其重量比為亞硫酸鈉硝酸銨尿素=2552:815:2535。上述堿性蛋白酶的制造方法為(1)菌種培養采用種子培養基對枯草芽孢桿菌種進行擴大培養；(2)發酵培養基配制；(3)發酵將枯草芽孢桿菌菌種接入搖瓶，進行發酵得發酵液；(4)粗提發酵液經預處理后離心，脫色，過濾和減壓干燥得粗品堿性蛋白酶；(5)精制粗品經純化溶解后，鹽析，透析，超濾濃縮，凝膠過濾層析，然后干燥濃縮得成品。上述發酵過程中發酵培養基配方(w/w)為葡萄糖1.2%、蔗糖0.6%、淀粉1.2%，豆餅粉3%，酵母粉0.3%，K2HP043H200.2%;發酵時間為36h，溫度為36'C，初始ra值8.0，搖瓶轉速150r/min。消泡劑為0.3%-0.6%花生油。與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下本發明涉及一種活性物質為BQ-An堿性蛋白酶的殺蟲劑，其通過枯草芽孢桿菌BQ-An為出發菌株，進行微生物發酵，提取到具有殺蟲活性的堿性蛋白酶，經過大量藥效試驗證明，該活性物質具有與環境相容、選擇性強、防效高、無殘留等特點，且殺蟲譜廣，對小齡幼蟲防治效果顯著。四圖l為本發明發酵工藝圖；圖2為本發明菌株篩選圖。五具體實施例方式本發明為一種農藥。通過土壤中的微生物BQ-An發酵提取得到的具有殺蟲活性的堿性蛋白酶，以其為主要活性物質的生產高效微生物殺蟲劑，具有無毒、高效、低殘留的特點，可有效防治小齡幼蟲。實施例1、樣品采集按照多點取樣(不同地點、不同土層深度)混合的方法，鏟去表層土，采用簡易打孔器，打取深度為3—15cm的土樣，裝入無菌牛皮紙袋或鋁盒中，做好記錄。采集的土樣應沒有大的顆粒，帶回實驗室陰干后立即進行分離培養。其中取樣的土壤為任何普通的土壤，任何普通的土壤中均含有枯草芽孢桿菌，即取樣不受客觀條件的限制，具有重復性。2、分離與純化(參見圖2):將采來的土樣陰干、研磨后，稱取5g，放入150ml盛有45ml生理鹽水的三角瓶中，搖動3-5min，在8(TC水浴中加熱10min，殺滅不產芽孢的細菌和其他菌類。采用土壤稀釋分離法，吸取lmL的稀釋液加入到含有9mL水的試管中，振蕩混勻，制得10—2土壤稀釋液；按照上述方法分別制取10-3、10-4、10-5土壤稀釋液。分別取10-3、10-4、10-5土壤稀釋液0.05mL涂布于牛肉膏蛋白胨培養基平板上。倒置在28t:的恒溫培養箱中培養48h。挑取單菌落，鏡檢，采用劃線分離的方法純化。初篩(1)初篩培養基(%)(w/w):脫脂奶粉6.0;酵母膏0.1;葡萄糖0.1;MgS04.7H2O0.01;KH2PO40.05;K2HPO40.l;瓊脂2.0;pH7.0。(2)用接種環將分離得到的菌株接種在彈性蛋白平板培養基上，并置于37。C培養2—3天，然后觀察直徑和透明圈大小，以透明圈直徑與菌落直徑的比值(HC值)作為初篩指標。將比值大的用稀釋倒平板或劃線法進行分離純化，挑取單菌落接入斜面，于37"C培養24-32小時。3、復篩(參見圖2):(1)發酵培養基(％)(w/w):酪蛋白3.0;葡萄糖4.0;玉米提取液2.0;K2HPO40.2;MgS047H200.01;pH6.0。(2)將初篩所得菌株分別接種到基礎發酵培養基中，搖床振蕩發酵24小時后，4°C、4000rpm離心30分鐘，取上清液，用標準底物、分光光度計測定各菌株彈性蛋白酶的活力反復試驗，選擇一株活力最高的菌株作為發酵菌株。酶活測定參照工業部頒國家標準方法進行。4、微生物發酵條件優化1、發酵培養基優化(1)碳源選擇在原發酵基本培養基上，保持碳源含量不變，分別采用葡萄糖、蔗糖、淀粉、葡萄糖+蔗糖(1:1)、蔗糖+淀粉(1:1)、葡萄糖+淀粉(1:1)及葡萄糖+蔗糖+淀粉(2:1:2)等有機物作為碳源，以不加任何碳源作為對照。(2)氮源選擇選擇(1)試驗中抑菌效果最好的碳源組成方式作為碳源，改變氮源的組成。供選擇的氮源有蛋白胨、酵母粉、豆餅粉、尿素、玉米漿、麥麩、(NH4)2S04,以不加任何氮源作對照。(3)無機離子選擇按照已篩選好的最佳碳源、最佳氮源作為碳氮源，稱取適量的無機鹽，使得金屬離子在培養基中的濃度為0.02mol/L，以不加任何無機離子為對照。供選擇的無機鹽有硫酸鋅、硫酸錳、硫酸亞鐵、硫酸鐵、磷酸氫二鉀及硫酸鎂。(4)最優培養基正交實驗從上述培養基基本成分研究中，確定最佳碳源和氮源及加入的無機鹽種類。為進一步確定各培養基成分因子含量之間的相關性，選取碳源、氮源、生長因子(酵母膏)和無機鹽等4個因素進行正交篩選試驗。每個因素取3個水平，根據正交表"(34)設計實驗。表l培養基組分U(34)正交實驗因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注A:葡萄糖+蔗糖+淀粉；B:豆餅粉；C:酵母膏；D:磷酸氫二鉀發酵培養基ra的選擇-用4mol/LHC1和1mol/LNaOH將培養基pH值調節為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0，最適溫度下，150r/min搖床培養38h，取發酵液測酶活。3、發酵時間的選擇將菌株發酵時間分別設成6、12、18、24、30、36、42、48h，調節pH為7.0，36。C下150r/min搖床培養，取發酵液測酶活。4、發酵溫度的選擇將菌株發酵溫度設成21、24、27、30、33、36、40°C，150r/min搖床培養，取發酵液測酶活。5、搖床轉速的選擇將搖瓶的轉速分別設為120、150、175、200、230r/min，調節最適pH，最適溫度下，培養36h，取發酵液測定酶活。6、消泡劑的選擇于已知最適條件下搖瓶發酵。在發酵液中加入不同的花生油作為消泡劑，進行酶的產生試驗。結果篩選得到最佳發酵培養基配方(w/w)為葡萄糖1.2%+蔗糖0.6%+淀粉1.2°/。，豆餅粉3%，酵母粉0.3%，K2HP043H200.2%;最佳發酵時間36h，最佳溫度36。C，初始最佳PH值8.0，搖瓶轉速150r/min。消泡劑以0.3%-0.6%花生油為宜。5、微生物發酵產物的提取和純化工藝為(參見圖1)1、發酵液的預處理(1)發酵液的預處理-取發酵完畢的發酵液100ml，加入絮凝劑NaA102，室溫攪拌8min后靜置待分層。絮凝劑NaA102的用量以質量百分比0.1%—0.15%為適宜。(2)、發酵液的提取a離心將預處理后的發酵液的上清液裝入離心管，在4"C條件下8000r/min離心8min;b脫色向洗脫液中加入1%的活性炭，用水浴加熱至90。C，保溫攪拌30分鐘，趁熱過濾，取濾液低溫干燥可得粗蛋白酶。C鹽析將上述所得粗蛋白酶溶解，調pH為7.8，在冰浴條件下邊攪拌邊加入60%(w/w)的飽和硫酸銨溶液中，然后繼續攪拌lh放置于4"C條件下4000r/min離心30min，收集沉淀，溶于0.2mol/L、pH7.4的硼酸緩沖液中，再用0.05mol/L的硼酸緩沖液透析。d超濾將透析所得酶液置于超濾容器中在4"C的環境中，在氮氣壓力0.5個大氣壓力下，用截留分子量為10萬的膜超濾5h，收集截留的液體。eS印hadexG—75凝膠柱層析在低溫4'C的環境下，選擇S印hadexG—75作為填充介質。稱取一定量的S印hadexG—75在沸水中充分溶脹，冷卻，裝柱。將DEAE-S印hadexA50收集到的活性峰濃縮后上樣。用O.lmol/LpH7.4的Tris-HCL緩沖液進行洗脫，洗脫速度為0.5ml/min，用核酸/蛋白檢測儀檢測，收集堿性蛋白酶活性組分。然后冷凍干燥濃縮于4'C保存。本發明活性物質為堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑的制備過程用芽孢桿菌BQ-An作生產菌株，選擇用最佳培養基進行發酵，對發酵也濃縮提取活性物質堿性蛋白酶后，加入表面活性劑、增效劑、助劑、填料等，攪拌后即可包裝。微生物殺蟲劑主要組分比例為(w/w):堿性蛋白酶9%_16%表面活性劑1%_2%高滲劑1%-1.5%增效劑1%-3%助劑3%-5°/。水68%-84%表面活性劑為苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚，助劑為三聚磷酸鈉，高滲劑為0P-80，增效劑由氯化鎂、亞硫酸鈉、硝酸銨、蔗糖和5種原料中的2種或2種以上的原料組配而成。所含各種原料及其重量比為亞硫酸鈉硝酸銨尿素=2552:815:2535。本發明活性物質為堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑室內藥效試驗1、分析方法；藥膜法測定殺蟲劑對小齡幼蟲的觸殺毒力將殺蟲劑等比稀釋成5個梯級濃度(X109、X108、X107、X106、X105)。在閃爍瓶(直徑X高二25mmX55mm)中加入0.5ml藥液，每處理重復3次，以不加殺蟲劑為對照。加好藥液后閃爍瓶平放在水平桌面上滾動，使閃爍瓶內側形成均勻的藥膜。每瓶接5頭幼蟲，瓶子橫放，讓試蟲在藥膜上爬行3h,然后轉入有孕穗期連根(用脫脂棉包住并加水保濕)小麥莖(高約10cm)的礦泉水瓶中(倒放)，再接入食料。用海綿塞封住礦泉水瓶瓶口。最后將試蟲置于25。C、光周期14:10h(L:D)的光照培養箱中，2d后檢査死蟲數。殺蟲劑毒力的評判在確定殺蟲劑的處理標準濃度后，對藥劑處理后的藥劑致死率加以校正，可直接查Abbort校正值表得到。用DPS軟件對數據進行處理，計算毒力回歸方程式、相關系數及LC5。。毒力回歸方程LC50(uI7L)y=2.5249+1.9562x0.956218.4188權利要求1、一種活性物質為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其特征在于包括以下重量百分比的組分堿性蛋白酶9％-16％表面活性劑1％-2％高滲劑1％-1.5％增效劑1％-3％助劑3％-5％水68％-84％2、根據權利要求1所述的一種活性物質為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其特征在于表面活性劑為苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚，助劑為三聚磷酸鈉，增效劑由氯化鎂、亞硫酸鈉、硝酸銨、蔗糖和5種原料中的2種或2種以上的原料組配而成，所含各種原料及其重量比為亞硫酸鈉硝酸銨尿素=2552:815:2535。3、根據權利要求1所述的一種活性物質為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其特征在于堿性蛋白酶的制造方法為(1)菌種培養采用種子培養基對枯草芽孢桿菌種進行擴大培養；(2)發酵培養基配制；(3)發酵將枯草芽孢桿菌菌種接入搖瓶，進行發酵得發酵液；(4)粗提發酵液經預處理后離心，脫色，過濾和減壓干燥得粗品堿性蛋(5)精制粗品經純化溶解后，鹽析，透析，超濾濃縮，凝膠過濾層析，然后干燥濃縮得成品。4、根據權利要求3所述的一種活性物質為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其特征在于發酵過程中發酵培養基配方為葡萄糖1.2%、蔗糖0.6%、淀粉1.2%，豆餅粉3%，酵母粉O.3%，K2HP043H200.2%，其中百分比為w/w;發酵時間為36h,溫度為36。C，初始ra值8.0，搖瓶轉速150r/min。消泡劑為0.3%-0.6%花生油。全文摘要本發明涉及一種活性物質為枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的微生物殺蟲劑，其低殘留、殺蟲譜廣、高效、能降解、選擇性強。本發明包括以下重量百分比的組分堿性蛋白酶9％-16％，表面活性劑1％-2％，高滲劑1％-1.5％，增效劑1％-3％，助劑3％-5％，水68％-84％。上述表面活性劑為苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚，助劑為三聚磷酸鈉，增效劑由氯化鎂、亞硫酸鈉、硝酸銨、蔗糖和5種原料中的2種或2種以上的原料組配而成，所含各種原料及其重量比為亞硫酸鈉∶硝酸銨∶尿素＝25～52∶8～15∶25～35；還摻入微量的堿金屬鹽類MgCl₂或K₂O₃等作為添加劑。文檔編號A01P7/00GK101396025SQ20081023171公開日2009年4月1日申請日期2008年10月13日優先權日2008年10月13日發明者劉雙發,安德榮申請人:西北農林科技大學