本發明涉及微生物技術領域，具體而言，涉及一種堅強芽孢桿菌菌劑及其制備方法與應用。
背景技術：
根結線蟲是一種雜食性植物病原線蟲，主要侵染作物根系,使根部腫大、畸形、呈雞爪狀,根組織變黑腐爛,也有的根上產生球狀根結,侵染后植株表現為缺水癥狀，中午萎蔫，早晚初期尚能恢復，到后期植株不能正常生長，甚至死亡。根結線蟲是我國糧食、蔬菜、經濟作物的重大病原物之一，目前根結線蟲成為了北方保護地蔬菜毀滅性病害，也是南方露地栽培果蔬的主要病害。根結線蟲通常沒有明顯的專性寄主，能夠侵染的植物超過2000種。全國各種根結線蟲發生面積超過2000萬畝，受害最嚴重的有煙草、香蕉及蔬菜類的茄科(如番茄、茄子、辣椒)、葫蘆科(如各種瓜類)等作物。給作物生產帶來巨大經濟損失。特別是煙草，我國是煙草種植和消費大國，也是最重要的經濟植物之一，煙草根結線蟲在四川、重慶、河南、云南、廣西、湖南、湖北及山東等地發生嚴重，且有繼續加重的趨勢。
長期以來，煙草等作物的根結線蟲防治一般以阿維菌素、噻唑磷等農藥為主，但使用阿維菌素、噻唑磷等一般都會對煙草的根系造成一定的損傷，且效果不理想；微生物農藥防治根結線蟲，可有效減輕線蟲的發生，且可抑制線蟲攜帶的病菌，改善根部微生態環境，刺激作物生長；在微生物防治逐漸成為植物病害防治研究熱點的今天，研究開發和利用微生物農藥來防治煙草等作物的根結線蟲病害無疑是最佳出路。
有鑒于此，特提出本發明。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種堅強芽孢桿菌菌劑，以解決上述問題。
為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：
一種堅強芽孢桿菌菌劑，每克所述菌劑含有1×1010～12芽孢桿菌活孢子；
所述堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC NO.1.2010。
堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)的形態學和生理性質特征為：菌體細胞桿狀，革蘭氏染色陽性，兩端鈍圓，無莢膜，周生鞭毛，芽孢卵圓形，近中生，孢囊無明顯膨大。NA培養基35℃培養24h，菌落直徑1～2mm，挑起有粘絲，菌落為微黃白色，圓形或近圓形，中間環狀，不透明，表面褶皺，稍有光澤；培養48h后，菌落呈中間心環狀凸起，呈火山口狀。常規生理生化實驗表明，是好氧菌，接觸酶，氧化酶，VP試驗呈陽性，在7％的NaCl中生長，pH5.7生長。
堅強芽孢桿菌能產生芽孢，具有極強的抗逆性,可以用于防治煙草、香蕉和番茄等作物的根結線蟲病，且對人畜安全、環境相容性好、有害生物不易產生抗藥性、無污染、微毒無殘留。
可選的，所述菌劑的劑型為可濕性粉劑。
如上所述的堅強芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括如下步驟：
將預先制備好的堅強芽孢桿菌種子液接種到發酵培養基中進行發酵，將得到的發酵液經濃縮、干燥并制劑得到所述堅強芽孢桿菌菌劑。
可選的，如上所述的堅強芽孢桿菌菌劑的制備方法，所述發酵培養基含有酵母粉25±4g/L，玉米淀粉20±5g/L，葡萄糖10±2g/L，氯化鈣3±0.5g/L，豆粕粉10±5g/L，消泡劑1.4±0.2g/L，pH＝8.1～8.3。
可選的，如上所述的堅強芽孢桿菌菌劑的制備方法，所述堅強芽孢桿菌種子液的制備方法包括：
A)、在固體營養瓊脂培養基上劃線接種堅強芽孢桿菌，30℃～37℃培養72h～120h得到菌種Ⅰ；
B)、取菌種Ⅰ的單菌落接入固體的營養培養基中，30℃～37℃培養72h～120h得到菌種Ⅱ；
C)、用無水沖洗菌種Ⅱ，按照0.05％～0.5％的體積比向液體的營養培養基中接入菌種Ⅱ孢子懸浮液，30℃～37℃、150r/min～250r/min培養18h～30h，得到堅強芽孢桿菌種子液；
可選的，所述營養培養基含有蛋白胨10±2g/L、牛肉膏3±0.5g/L、氯化鈉5±1g/L，pH＝7.1～7.5。
可選的，如上所述的堅強芽孢桿菌菌劑的制備方法，所述堅強芽孢桿菌種子液接種量占所述發酵培養基體積的0.05％～1％；
發酵條件為發酵溫度30℃～35℃，通氣比為(05.～1)：1，轉速150～200r/min，發酵40～48小時。
如上所述的堅強芽孢桿菌菌劑在防治根結線蟲中的應用。
可選的，如上所述的應用，所述堅強芽孢桿菌菌劑與其他藥劑混合使用；
所述藥劑包括微生物菌劑和/或殺線藥劑。
可選的，所述其他微生物菌劑的主要成分包括厚孢輪枝菌、淡紫擬青霉、枯草孢桿菌、側胞芽孢桿菌、蠟質芽孢桿菌。
可選的，所述殺線藥劑包括阿維菌素、噻唑磷、氟吡菌酰胺、氨基寡糖素、克百威、丁硫克百威、滅線磷。
可選的，如上所述的應用，所述根結線蟲的宿主包括煙草、香蕉、番茄、蘋果、梨、山楂、柑桔、棗、茄子、辣椒、黃瓜、西瓜、哈蜜瓜、西葫蘆、大豆、玉米、花生。
可選的，如上所述的應用，當所述宿主為煙草時，施用堅強芽孢桿菌菌劑的方法為穴施；
可選的，所述穴施在煙草移栽時進行。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
本發明提供了一種堅強芽孢桿菌菌劑及其制備方法與應用。
每克所述菌劑含有1×1010～12芽孢桿菌活孢子；
所述堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC NO.1.2010。
優選的，所述菌劑的劑型為可濕性粉劑。
可濕性粉劑是我國目前農用微生物殺菌劑的主要劑型。優選的，本發明提供的菌劑還可制備成粉劑、水分散粒劑、懸浮劑和顆粒劑等劑型進行使用。
如上所述的堅強芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括如下步驟：
將預先制備好的堅強芽孢桿菌種子液接種到發酵培養基中進行發酵，將得到的發酵液經濃縮、干燥并經氣流粉碎得到所述堅強芽孢桿菌菌劑。
優選的，所述濃縮為選用陶瓷膜過濾濃縮；
進一步優選的，所述陶瓷膜孔徑為0.01μm～0.1μm，。
優選的，所述干燥為離心式噴霧干燥，進風溫度120℃～220℃，出風溫度60℃～90℃；
優選的，如上所述的堅強芽孢桿菌菌劑的制備方法，所述發酵培養基含有酵母粉25±4g/L，玉米淀粉20±5g/L，葡萄糖10±2g/L，氯化鈣3±0.5g/L，豆粕粉10±5g/L，消泡劑1.4±0.2g/L，pH＝8.1～8.3。
優選的，如上所述的堅強芽孢桿菌菌劑的制備方法，所述堅強芽孢桿菌種子液的制備方法包括：
A)、在固體的營養培養基上劃線接種堅強芽孢桿菌，30℃～37℃培養72h～120h得到菌種Ⅰ；
B)、取菌種Ⅰ的單菌落接入固體的營養培養基中，30℃～37℃培養72h～120h得到菌種Ⅱ；
C)、用無菌水沖洗菌種Ⅱ，按照0.05％～0.5％的體積比向液體的營養培養基中接入菌種Ⅱ孢子懸浮液，30℃～37℃、150r/min～250r/min培養18h～30h，得到堅強芽孢桿菌種子液；
其中，所述菌種Ⅱ能在4℃以下保存三個月。
優選的，所述營養培養基含有蛋白胨10±2g/L、牛肉膏3±0.5g/L、氯化鈉5±1g/L，pH＝7.1～7.5。
進一步優選的，所述固體的營養培養基中還需要加入15±3g/L的瓊脂。
優選的，所述堅強芽孢桿菌種子液中孢子數為(0.3～0.9)×109個。
優選的，如上所述的堅強芽孢桿菌菌劑的制備方法，所述堅強芽孢桿菌種子液接種量占所述發酵培養基體積的0.05％～1％；
發酵條件為發酵溫度30℃～36℃，通氣比為(0.5～1)：1，轉速150～200r/min，發酵40～48小時。
如上所述的堅強芽孢桿菌菌劑在防治根結線蟲中的應用。
本領域技術人員根據本發明說明中記載的內容推斷，本發明的菌劑還可以與常見的其他微生物菌劑和/或殺線藥劑混合使用。
優選的，所述其他微生物菌劑的主要成分包括厚孢輪枝菌、淡紫擬青霉、枯草孢桿菌、側胞芽孢桿菌、蠟質芽孢桿菌。
優選的，所述殺線藥劑包括阿維菌素、噻唑磷、氟吡菌酰胺、氨基寡糖素、克百威、丁硫克百威、滅線磷。
優選的，如上所述的應用，所述根結線蟲的宿主包括煙草、香蕉、番茄、蘋果、梨、山楂、柑桔、棗、茄子、辣椒、黃瓜、西瓜、哈蜜瓜、西葫蘆、大豆、玉米、花生。
優選的，如上所述的應用，當所述宿主為煙草時，施用堅強芽孢桿菌菌劑的方法為穴施；
除穴施外，還可采用溝施、撒施。
優選的，所述穴施在煙草移栽時進行。
進一步優選的，將1×1010活芽孢/克堅強芽孢桿菌可濕性粉劑與干細土按1：100混勻做成備用藥粉，每株煙草用藥粉40～60克。
實施例1
1.1、堅強芽孢桿菌種子液的獲得
1.1.1、堅強芽孢桿菌菌種活化：用接種環挑取三環堅強芽孢桿菌凍干菌種于250ml三角瓶中，采用固體的營養培養基，35℃培養18h。
1.1.2、劃線法固體平板培養
在固體的營養培養基平板上35℃培養100h，長出單菌落。
1.1.3、試管斜面培養：固體的營養培養基試管斜面，挑取上述單菌落接于試管斜面，35℃培養100h，直到孢子散落。
從上述試管斜面中選用較好的菌種，用無菌水將試管斜面種子沖洗，接于裝有液體的營養培養基的750mL三角瓶中，于35℃、搖床轉速200r/min培養24h，菌體含量達到0.6×109個/mL左右時，即可作為種子液。
上述固體的營養培養基的配方為：蛋白胨10克，牛肉膏3克，氯化鈉5克，瓊脂15克，蒸餾水1000ml，PH值7.3；
液體的營養培養基的配方為：蛋白胨10克，牛肉膏3克，氯化鈉5克，蒸餾水1000ml，PH值7.3。
1.2、堅強芽孢桿菌發酵液的制備
發酵培養基：按質量百分數計，含有酵母粉2.5％，玉米淀粉2.0％，葡萄糖1.0％，氯化鈣0.3％，豆粕粉1.0％，消泡劑0.14％，其余為水，調節PH 8.1～8.3。
50升全自動控制不銹鋼發酵罐進行消毒：用蒸汽121℃消毒1小時。
向發酵罐裝料：裝料系數為0.6，加入酵母粉750g，玉米淀粉600g，葡萄糖300g，氯化鈣90g，豆粕粉300g，消泡劑42g，用水配置，溶解后得到30L發酵培養基，通入蒸汽，于121℃消毒1.0小時，查無雜菌。
發酵最佳參數：發酵溫度30℃～36℃，初始PH值為8.1～8.3，通氣量為1︰1，攪拌轉速200r/min，接種量為1％，發酵44小時，孢子量為2×109/mL時，即到終點，得26.5公斤的發酵液。
1.3、發酵液的濃縮：
將26.5kg的發酵液裝入膜分離裝置的料液槽，采用孔徑為0.1μm的陶瓷膜，膜面積為0.25㎡，開啟循環泵進行分離，循環3小時后得到7.0kg濃縮液。
1.4、濃縮液噴霧干燥：
采用脫水量為3kg/h的離心式噴霧干燥塔，進風溫度140℃，出風溫度70℃，將7.0kg堅強芽孢桿菌濃縮液進行噴霧干燥，經三小時得375g堅強芽孢桿菌母粉，經檢測孢子量為1.2×1011活孢子/克的堅強芽孢桿菌母藥。
實施例2
堅強芽孢桿菌對煙草根結線蟲(Meloidogyne incongnita Chitwood)的室內活性測定
從發病比較嚴重的煙草根部挑取煙草根結線蟲的蟲癭，放置于培養皿內的尼龍網膜上，加適量無菌水，置于(25±1)℃培養箱孵化培養，48h后收集二齡幼蟲配制成線蟲懸浮液，每1mL懸浮液中含有約200頭的二齡幼蟲，備用。
選用2.5×109活孢子/克厚孢輪枝菌(verticillium chlamydosporium)母藥為對照藥。生產廠家：云南陸良酶制劑有限責任公司。
將1×1011活孢子/克堅強芽孢桿菌母藥和2.5×109活孢子/克厚孢輪枝菌母藥分別用無菌水溶解，制成1.00×104mg/L濃度母液，備用。
根據預備實驗的結果，將堅強芽孢桿菌母液稀釋成200、100、50、25、12.5mg/L，厚孢輪枝菌母液稀釋成200、100、50、25、12.5mg/L不同濃度試驗藥液待用。
采用直接觸殺法進行測定。取24孔生化測試板，各取1mL供試藥液置于小孔中，加入等體積的線蟲懸浮液，空白對照加入等量的無菌水，置于(25±1℃)培養箱培養。
處理后24h調查試蟲死亡情況(判斷供試蟲死亡標準是以顯微鏡下觀察無自主反應)，每處理調查100頭，記錄總蟲數和死蟲數。
試驗結果表明，堅強芽孢桿菌對煙草根結線蟲的殺線活性明顯高于厚孢輪枝菌的殺線活性。
表1堅強芽孢桿菌對煙草根結線蟲的室內活性測定原始數據
實施例3
不同藥劑防治煙草根結線蟲田間藥效試驗
選用三種常用藥劑:2.5×109活孢子/克厚孢輪枝菌微粒劑、3％阿維菌素微囊懸浮劑、10％噻唑磷顆粒劑與1×1010活芽孢/克堅強芽孢桿菌可濕性粉劑對煙草根結線蟲病進行田間藥效試驗，試驗結果表明，堅強芽孢桿菌(800克/畝)防效最高為84.87％，2.5×109活孢子/克厚孢輪枝菌微粒劑和3％阿維菌素微囊懸浮劑分別為75.57％和76.06％，10％噻唑磷顆粒劑最低為68.28％。田間藥效試驗原始數據見表2。
表2四種不同藥劑防治煙草根結線蟲田間藥效試驗結果
實施例4
堅強芽孢桿菌不同時期、不同方式用藥對煙草根結線蟲的防治效果試驗
將1×1010活芽孢/克堅強芽孢桿菌可濕性粉劑與干細土按1：100混勻做成備用藥粉(穴施、溝施、撒施，每株用藥粉約50克)；
將1×1010活芽孢/克堅強芽孢桿菌可濕性粉劑按1:200對水混勻做成備用藥液(灌根，每株用藥液約100毫升)。
試驗選在同一田塊內，肥水相同，分6組處理：第一組移栽時穴施；第二組移栽時溝施；第三組移栽后撒施；第四組移栽后用藥液作為定根水灌根；第五組移栽后20天灌根；第六組是對照組，不施藥粉或藥液；每組實驗重復3次。然后在封頂、打頂后25天、采烤結束時分別觀察其病珠情況，并記錄。
實驗結果如表3，試驗表明，用1×1010活芽孢/克堅強芽孢桿菌可濕性粉劑防治煙草根結線蟲，在煙草移栽時穴施效果最好。
表3各處理防效統計結果
注:表中各數據均為3次重復的平均值。
盡管已用具體實施例來說明和描述了本發明，然而應意識到，在不背離本發明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發明范圍內的所有這些變化和修改。