一種解淀粉芽孢桿菌及其在醬油釀造中的應用的制作方法

本發明涉及一種解淀粉芽孢桿菌及其在醬油釀造中的應用，屬于食品微生物技術領域。

背景技術：

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一種致癌物質，被人體持續過量攝入可能會引發肺癌、肝癌等嚴重腫瘤疾病，并且對人體的免疫系統造成傷害。

醬油是食品工業廣泛使用的一種發酵調味品，是具有獨特色、香、味的營養豐富的功能性食品，在中國已有2500年的生產歷史。近年的研究結果表明，潛在的致癌物質氨基甲酸乙酯(EC)，在醬油中尤其是日式工藝所生產的醬油中廣泛存在，這嚴重的影響了醬油的食品安全性。

釀造醬油中氨基甲酸乙酯的主要前體物質是瓜氨酸與乙醇。因此降低醬油中瓜氨酸的含量是我們降低醬油中氨基甲酸乙酯有效措施之一。在醬油生產前期，原料水解出大量精氨酸，這些精氨酸在一大類厭氧或兼性厭氧的乳酸菌的作用下，被轉化為瓜氨酸。如果這些精氨酸被一些具有完整精氨酸脫亞氨基途徑的菌株利用，將精氨酸轉化成鳥氨酸，就能降低醬油中的瓜氨酸積累。因此，篩選一株能夠耐受高鹽，并且能夠高效轉化精氨酸且不積累瓜氨酸的菌株，對于降低醬油中氨基甲酸乙酯的含量有重要應用價值。

技術實現要素：

本發明的第一個目的是提供一種可高效利用精氨酸和瓜氨酸的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)JY06-E6，已于2016年9月19日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2016497，保藏地址為中國武漢，武漢大學。

本發明的第二個目的是提供所述解淀粉芽孢桿菌JY06-E6的培養方法，所述方法是將所述解淀粉芽孢桿菌JY06-E6接種至含80～150g/LNaCl的LB培養基，30℃靜置培養24～48h。

在本發明的一種實施方式中，所述解淀粉芽孢桿菌JY06-E6培養條件為：將保藏菌株在含100g/LNaCl的LB固體培養基上劃線，于37℃靜置培養2d，挑取單菌落接入含100g/L NaCl的LB液體培養基，37℃靜置培養36h。

本發明的第三個目的是提供一種制備醬油的方法，是將所述解淀粉芽孢桿菌JY06-E6接種至醬醪中。

在本發明的一種實施方式中，所述方法是在醬油發酵的第0-3d接種解淀粉芽孢桿菌至醬醪中解淀粉芽孢桿菌達到10⁶CFU/mL至10⁸CFU/mL。

在本發明的一種實施方式中，所述方法具體是：(1)制曲：脫脂大豆與炒麥經浸泡、滅菌、降溫后，加入麩皮、面粉，并接種米曲霉孢子，培養，待曲變成嫩綠色，制曲完成；(2)發酵：成曲拌鹽水，開始發酵，在發酵的起始至第0-3天內接種解淀粉芽孢桿菌，控溫10-20℃，發酵第7d接種10⁷CFU/mL(最終在醬醪中的濃度)的魯氏酵母，發酵第14d再接種魯氏酵母至10⁷CFU/mL(最終在醬醪中的濃度)，30℃恒溫發酵，第90d結束發酵。

本發明還提供所述解淀粉芽孢桿菌JY06-E6在降低食品中氨基甲酸乙酯方面的應用。

本發明還提供所述解淀粉芽孢桿菌JY06-E6在制備發酵食品、調味品、保健品中的應用。

有益效果：本發明的解淀粉芽孢桿菌JY06-E6能夠在高鹽條件下高效利用精氨酸和瓜氨酸，其對精氨酸的利用率達到了95.7％，不積累瓜氨酸，且具備良好的傳代穩定性。將該菌株添加至醬油釀造過程中，能夠使氨基甲酸乙酯的前體物瓜氨酸含量降低14.6％，有助于控制和降低醬油氨基甲酸乙酯的含量。

附圖說明

圖1為突變株JY06-E6的遺傳穩定性；JY06，解淀粉芽孢桿菌BBE-JY06；E6，解淀粉芽孢桿菌JY06-E6；*代表傳代200代后的菌株。

生物材料保藏

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)JY06-E6，已于2016年9月19日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2016497，保藏地址為中國武漢，武漢大學。

具體實施方式

氨基酸檢測培養基：酵母膏5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl 180g/L，葡萄糖0.5g/L，Tween-801g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.05g/L，FeSO₄0.4g/L，檸檬酸三胺2g/L，CaCO₃0.1g/L，吡哆醛-5-磷酸0.05g/L，K₂HPO₄2g/L，pH 6.0。用于檢測特定氨基酸時，添加待測氨基酸6g/L。

解淀粉芽孢桿菌JY06-E6培養方法：將保藏的誘變菌株在含100g/LNaCl的LB固體培養基上劃線，于30℃靜置培養2d，挑取單菌落接入含100g/LNaCl的LB液體培養基，30℃靜置培養36h。

實施例1解淀粉芽孢桿菌的篩選

根據如下步驟進行篩選：

(1)以保藏編號為CCTCC NO:M 2015423的解淀粉芽孢桿菌BBE-JY06(簡寫作解淀粉芽孢桿菌JY06)作為出發菌株，將解淀粉芽孢桿菌JY06接種至LB液體培養基，37℃，220r/min搖床培養至對數生長期；

(2)將超凈工作臺的紫外燈打開預熱15～30min；取適量菌液加入無菌培養皿中，在15W紫外燈30cm處分別照射0s、20s、40s、60s、80s、100s、120s；照射完成后將菌體轉入無菌試管中并立即放入冰水中；在避光條件下，分別取照射菌液和未照射菌液進行稀釋涂布，計算活菌細胞數，從而得到致死率；再培養后取適量的照射菌液加到LB培養基中，用錫箔紙包好避光，在37℃，120rpm/min恒溫搖床中培養2～4h；在避光條件下將活化菌液稀釋至10^-4～10^-6三個濃度，取稀釋液涂布于篩選培養基中，用黑布包好避光，置于37℃恒溫培養箱中培養24～36h，每個處理重復三次；挑取菌落進行精氨酸顯色復篩。

移取50μL滿足初篩條件的菌株所對應的上清液于1.5mL的離心管中，然后再分別向離心管中加入40g/LNaOH溶液、80g/L甲萘酚正丙醇溶液和0.5mL/L雙乙酰正丙醇溶液各1mL，震蕩搖勻后，放入30℃水浴鍋中顯色15min。取出冷卻一段時間后，在分光光度計上測吸光值OD₅₄₀，以未接種的培養基作為對照。吸光值OD₅₄₀較小的菌株即為高效利用精氨酸的菌株。

實施例2解淀粉芽孢桿菌JY06-E6利用精氨酸能力分析

分別挑取平板上活化好的原始菌株解淀粉芽孢桿菌JY06和突變菌株解淀粉芽孢桿菌JY06-E6的單菌落接種于100g/LNaCl的LB液體培養基中，37℃靜置培養36小時，取5mL菌液8000rpm離心1min，棄上清，所獲菌體加入1mLpH7.0的磷酸鹽緩沖液重懸浮。

向5mL離心管中加入4mL含10g/L的精氨酸的氨基酸檢測培養基，接種500μL的懸浮菌液，接種后OD₆₀₀為7.8。30℃靜置培養3天后用HPLC的方法檢測培養基中精氨酸和瓜氨酸以及鳥氨酸含量

表1精氨酸代謝相關氨基酸含量

注：ΔArg(g/L)：精氨酸的消耗量；ΔCit(g/L)：瓜氨酸的生成量；ΔOrn(g/L)：鳥氨酸的生成量。

由表1可知，突變株代謝精氨酸的能力與對照相比提高了17.1％，并且精氨酸向鳥氨酸的轉化率也提高了55.8％。

實施例3：解淀粉芽孢桿菌JY06-E6傳代穩定性

分別將解淀粉芽孢桿菌JY06、突變株JY06-E6接種至LB液體培養基培養，37℃，220r/min培養，每隔24h轉接至新的LB液體培養基中，培養20d后，取4mL菌液離心去上清，用無菌水清洗菌體兩遍，加入等體積的精氨酸利用培養基，30℃靜置培養3～5d。

取1mL樣品，離心后取上清。用5％的三氯乙酸將上清液稀釋20倍后，經孔徑為0.22μm的濾膜過濾。用高效液相色譜法測定樣品中精氨酸含量。

如圖1所示，突變株JY06-E6對精氨酸利用情況的遺傳穩定性良好。傳代200代后，突變株JY06-E6代謝精氨酸的能力是原始菌株JY06的1.81倍，并且轉化成鳥氨酸的能力依然高出JY060.92倍。

實施例4：醬油制作

(1)制曲：脫脂大豆與炒麥浸泡8h，121℃滅菌5min，降溫至80℃，按比例加入麩皮、面粉，脫脂大豆、炒麥、麩皮、面粉的質量比為20:15:1:1，同時接入米曲霉孢子，接種量為8×10⁹個/g初始原料，30℃恒溫箱中培養，6-8h翻曲一次，培養46-48h，曲變成嫩綠色，制曲完成；

(2)發酵：成曲與20％的鹽水(w:v)以體積比為1:1.7的比例混合發酵，第0-3d分別接種解淀粉芽孢桿菌JY06和突變株JY06-E6，控溫10-20℃，發酵第7d接種終濃度為10⁷CFU/mL的魯氏酵母，發酵第14d再接種魯氏酵母至在醬醅中的終濃度為10⁷CFU/mL，30℃恒溫發酵，第90d結束發酵。

表2壓榨后原油中精氨酸代謝相關氨基酸含量

注：1為不添加JY06；2為第0～3d添加10⁷CFU/mL～10⁸CFU/mL的JY06；3為第0～3d添加10⁷CFU/mL～10⁸CFU/mL的JY06-E6。

表2數據表明，第0～3d分別添加了10⁷CFU/mL～10⁸CFU/mL解淀粉芽孢桿菌JY06和突變株JY06-E6的醬油樣品中，都能通過精氨酸脫亞胺酶代謝途徑將精氨酸大量轉化為鳥氨酸。并且第0～3d添加了10⁷CFU/mL～10⁸CFU/mL突變株JY06-E6的醬油樣品中瓜氨酸的含量最低，與添加了初始菌株JY06的醬油樣品相比，瓜氨酸含量降低了14.6％，氨基甲酸乙酯的含量降低了13.1％。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。