專利名稱：：椿樹耐鹽突變體的誘導及其鑒定方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，是一種椿樹耐鹽突變體的誘導及其鑒定方法。
背景技術：
：土壤鹽漬化是限制農業生產的一個世界性問題，我國現有鹽堿地2.7X10Thm2，其中7X106hm2為農田。天津市共有農業耕地47.85萬hm2，其中鹽漬化耕地的總面積為30.19萬hm2，并且隨著灌溉面積和設施栽培面積的不斷擴大，土壤的次生鹽漬化也在日趨嚴重。特別是濱海鹽堿地區由于含鹽量高，綠化受到限制，選育出耐鹽樹種進行栽植是治理這些鹽堿地的有效辦法。椿樹是天津市主要的鄉土樹種之一，其野生資源分布廣泛，管理粗放，多用于行道樹，是天津市的主要造林、綠化樹種。但其耐鹽潛力較小，在0.3%以上的咸水環境中難以存活。如何提高椿樹的耐鹽性，使其能在濱海鹽堿地上廣泛種植是一個亟需解決的重要問題。輻射誘變育種以其簡便、安全以及突變率高(比自然突變率高1001000倍，最高可達1/30)、變異譜擴大、能打破舊的性狀連鎖、實現基因重組且變異性狀穩定、短時間內可育出新品種等特點而成為品種改良的重要途徑之一。并在農作物、蔬菜和觀賞植物育種中取得了很多可喜的成果。近年來，利用6tlCoY射線誘變獲得耐鹽突變體的研究已陸續報道，有些已經應用于生產，取得了巨大的經濟效益和社會效益。但是有關椿樹輻射誘變育種的研究國內外尚未見報道，本發明旨在通過6tlCoY射線照射椿樹種子，誘發突變體發生，從中篩選出理想的園林綠化新品種，特別是適宜在濱海鹽堿地種植的耐鹽突變體。
發明內容本發明所要解決的技術問題是利用60Coγ射線照射椿樹種子，確定其半致死劑量和誘發基因突變的最適劑量，誘導突變體發生。建立利用溶液培養法快速鑒定耐鹽突變體的新方法。本發明的技術方案是—種椿樹耐鹽突變體的誘導及其鑒定方法，其特征在于包括如下步驟1)輻照處理將成熟、飽滿的椿樹的干種子，用輻射劑量5075Gy的6tlCo、射線進行輻照處理，劑量率為3.3Gy/min；獲得突變株；2)通過水培試驗篩選椿樹耐鹽突變體。將輻照處理后的椿樹種子采用盆播，每盆20粒，置于組培室培養，溫度26°C，光照12h。所述的水培篩選方法步驟為1)將苗齡30d的誘變椿樹苗在海鹽含量0.5%的Hongland溶液中進行水培培養，培養2周后，篩選出成活的耐鹽植株；2)將成活的耐鹽植物轉到無鹽的Hongland溶液中培養1周；3)再把耐鹽植株進一步用含有0.5%海鹽的Hongland溶液水培培養1_2周，再次篩選除去假陽性耐鹽植物，得到椿樹耐鹽突變體。篩選耐鹽突變體的水培溶液為Hongland溶液加海鹽配成質量百分含量0.5%的鹽溶液，海鹽購于天津長蘆鹽業公司，NaCl含量>94%。本發明效果是本發明用適當劑量和劑量率6tlCoY射線輻照處理椿樹的干種子，將輻照處理后的椿樹苗以含有海鹽的Hongland溶液進行水培篩選，獲得椿樹耐鹽突變體。本發明具有以下優點和特點(1)處理時間短，突變率高；(2)不涉及有毒化學物質，無毒無害，安全環保；(3)誘變育種群體大，數量多；(4)利用水培試驗篩選耐鹽突變體，水培試驗溶液均勻，能夠保證每一批每一棵苗木受到的鹽脅迫都一樣。此方法簡單易操作，能大規模快速選擇。圖1.1不同輻射劑量對發芽率的影響圖1.2輻照劑量與成苗率的關系圖1.3變異率和輻射劑量的關系圖1.4不同鹽度對椿樹生長的影響具體實施例方式一椿樹種子輻射劑量的確定以椿樹種子為材料，用6°Coγ射線進行了0、30、50、75、100、150和200Gy7個不同劑量的輻照處理，劑量率3.3Gy/min。椿樹種子的發芽率隨著劑量的增大而下降，劑量和發芽率成負相關。IOd后調查，輻射各組的發芽率明顯低于對照組，15d后調查，30Gy處理的發芽率和對照組基本持平，無明顯差異。50Gy—150Gy組明顯下降，200Gy組看不到種子萌發現象(圖1)。25d和30d的調查各組種子的發芽率趨于穩定，除30Gy組之外，其余各輻射組的發芽率明顯低于對照組，差異極顯著，200Gy使椿樹種子完全失活。我們觀察到各供試材料的萌發狀況，對照組種子發芽勢較強，發芽程度比較均勻，處理組隨著劑量的加大種子畸形損傷及死亡程度加大，當輻射劑量大于lOOGy，由于損傷的加重，種子的成苗率為零。在OIOOGy對成苗率進行回歸分析(圖2)，成苗率和輻射劑量的關系為y=-0.0078X+0.7877，相關系數為0.96，計算其半致死劑量(LD5tl)為50Gy。隨著輻射劑量的增大，變異類型加大，變異率也增大。但輻射劑量超過75Gy后，從實際觀察中我們可以看到，畸形葉片、受損葉片出現，出現生理性傷害，成苗數減少，使變異類型和變異率反而降低。在輻照育種中，輻照劑量過低誘變效率也低，劑量誘發突變的頻率增加，但同時也增強了輻射引起的損傷作用，因此適宜的輻射劑量是誘變育種的關鍵。關于輻射育種適宜輻射劑量的確定，一些學者建議，把植物成活率6070%時對應的劑量作為輻照的最適劑量，另外一些學者認為一般采用臨界劑量和半致死劑量，近年來多以植株存活率的50%左右為適宜育種劑量。但是，考慮到突變體的選擇分離和穩定需要消耗更多的時間和精力，適當提高輻射劑量以提高突變率不失為一種好的選擇。在本實驗中為了盡可能獲得大的變異和獲得一定數量的苗木，綜合考慮成活率和變異率，確定椿樹適宜的輻射劑量是5075Gy。二椿樹苗的耐鹽極限的確定1)椿樹種子進行育苗將成熟、飽滿的椿樹的干種子盆播，每盆20粒種子，置于組培室培養，溫度26°C，光照12h。按常規方法進行管理。2)耐鹽極限的確定采用水培方法，其中對照為Hongland營養液，其余為Hongland營養液加海鹽配成O(ck),0.1%,0.2%,0.3%,0.4%的水培溶液。把苗齡30d的椿樹苗置于以上不同海鹽含量的溶液中進行水培培養(圖4)，培養一周后，0.4%海鹽溶液中椿樹苗全部死亡。隨著時間的增加，培養二周后，0.的鹽溶液對椿樹苗的生長影響不大，株高稍低于對照。在0.2%的鹽溶液能成活，但生長受到抑制。在0.3%的鹽溶液中已開始出現枯萎死亡現象，據此認為椿樹苗的耐鹽極限是0.3%。三耐鹽突變體的篩選為了得到耐鹽突變體，同時防止苗木在逆境下自身適應能力的提高而影響篩選，我們最終把篩選濃度定為0.5%，先在鹽逆境下培養和篩選，然后把篩選的突變體培養在無鹽(正常的培養條件)條件下讓苗木消除自身對鹽逆境的適應能力，然后再培養在鹽逆境下進行篩選，最大程度地排除其因自身適應能力提高而被誤選的幾率。1)將苗齡30d的誘變椿樹苗在海鹽含量0.5%的水溶液中進行水培培養，培養2周后，篩選出成活的耐鹽植株；2)將成活的耐鹽植物轉到無鹽的Hongland溶液中培養1周；3)再把耐鹽植株進一步用含有0.5%海鹽的Hongland溶液水培培養1_2周，再次篩選除去假陽性耐鹽植物，得到椿樹耐鹽突變體。施例1將成熟、飽滿的椿樹的干種子，用輻射劑量5075Gy的6tlCo、射線進行輻照處理，劑量率為3.3Gy/min；將輻照處理后的種子采用盆播，每盆20粒，置于組培室培養，溫度26°C，光照12h。經過6tlCoγ射線輻射，椿樹葉色、葉形等等發生明顯變異，產生各種各樣的突變體。針對濱海新區土壤含鹽量高，主要想獲得耐鹽突變體，因此對誘變的椿樹苗進行了耐鹽篩選。將苗齡30d的誘變椿樹苗在海鹽含量0.5%的水溶液中進行水培培養，培養2周后，篩選出成活的耐鹽植株；將成活的耐鹽植物轉到無鹽的Hongland溶液中培養1周；再把耐鹽植株進一步用含有0.5%海鹽的Hongland溶液水培培養1_2周，再次篩選除去假陽性耐鹽植物，得到椿樹耐鹽突變體，從10000多株輻照當代植株中最終篩選到9株耐鹽突變體。Hongland溶液組成如表1。Hongland溶液組成<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求一種椿樹耐鹽突變體的誘導及其鑒定方法，其特征在于包括如下步驟1)輻照處理將成熟、飽滿的椿樹的干種子，用輻射劑量50～75Gy的60Co～γ射線進行輻照處理，劑量率為3.3Gy/min；獲得突變株；2)通過水培試驗篩選椿樹耐鹽突變體。2.根據權利要求1所述的椿樹耐鹽突變體的誘導及其鑒定方法，其特征在于將輻照處理后的椿樹種子采用盆播，每盆20粒，置于組培室培養，溫度26°C，光照12h。3.根據權利要求1所述的椿樹耐鹽突變體的誘導及其鑒定方法，其特征在于所述的水培篩選方法步驟為1)將苗齡30d的誘變椿樹苗在海鹽含量0.5%的Hongland溶液中進行水培培養，培養2周后，篩選出成活的耐鹽植株；2)將成活的耐鹽植物轉到無鹽的Hongland溶液中培養1周；3)再把耐鹽植株進一步用含有0.5%海鹽的Hongland溶液水培培養1_2周，再次篩選除去假陽性耐鹽植物，得到椿樹耐鹽突變體。4.根據權利要求3所述的椿樹耐鹽突變體的誘導及其鑒定方法，其特征在于篩選耐鹽突變體的水培溶液為Hongland溶液加海鹽配成質量百分含量0.5%的鹽溶液，海鹽購于天津長蘆鹽業公司，NaCl含量>94%。全文摘要本發明公開了一種椿樹耐鹽突變體的誘導及其鑒定方法。將成熟、飽滿的椿樹干種子，用輻射劑量50～75Gy的60Co～γ射線進行輻照處理，劑量率為3.3Gy/min；誘變后種子盆播獲得誘變的椿樹苗，將苗齡30d的椿樹苗進行水培篩選，獲得耐鹽突變體。本發明應用核輻射誘變及水培篩選方法，簡單易操作，處理時間短，突變率高，能大規模快速篩選，獲得椿樹的耐鹽突變體，為濱海鹽堿地的綠化提供材料。文檔編號A01H1/06GK101816284SQ20091006797公開日2010年9月1日申請日期2009年2月27日優先權日2009年2月27日發明者劉仲齊,張越,聶莉莉申請人:天津市農業生物技術研究中心